一种基于硅氧键断裂氟离子荧光探针的合成与研究

王金，徐亚杰，乔助，任君

(湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

氟化物在广泛的生物、医学和化学过程中发挥着至关重要的作用，如牙科保健、骨质疏松治疗、供水治疗，甚至化学武器.此外，氟化物很容易被人体吸收，但却是缓慢吸收的.但是，过量的氟化物可能会引起蛋白质损害，骨骼和甲状腺活动紊乱方面的疾病[1-2].考虑到这些有害的因素，探寻一种简单高效的方法来识别和检测F-在实际应用中是必不可少的.因此，开发用于环境和生物系统中F-的特异性传感和识别的有机小分子成为了一个非常热门的课题.其中，荧光探针具有成本低、灵敏度高、检测限低、合成简单等优点，还可用于活体细胞和体内的检测，在生物、化学和环境过程中的应用引起了人们的极大兴趣[3-6].之前已经有很多人报道过多种氟离子的荧光探针，但是大多数都是基于去质子化的识别原理[7-11]，很难在含水相的体系中完成对氟离子的有效识别.而实际应用中，氟离子都是存在于含水体系中，因此，这一类氟离子荧光探针并没有非常好的应用价值.而反应型的氟离子荧光探针[12-13]由于在含水的体系中仍然能够很好地检测氟离子，因此是我们的重点研究对象.基于此我们成功合成出了一种基于硅氧键的反应型氟离子荧光探针A，通过2-苯甲酰基吡啶和4-二乙胺基水杨醛合成出荧光探针分子A的荧光母体，我们以叔丁基二甲基氯硅烷作为我们荧光探针分子A的识别位点，通过各种表征和测试研究，验证了其对于氟离子有着高效，高灵敏度的识别效果，并且具有裸眼识别的能力.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器试剂：2-苯甲酰基吡啶；4-二乙氨基水杨醛；醋酸铵；浓硫酸；冰乙酸；叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)；N-N二甲基甲酰胺；咪唑等试剂均为市售分析纯，均无纯化.

仪器：核磁测试中使用WIPM核磁共振波谱仪(中科院400 MHz)和Varian UNITY INOVA核磁共振波谱仪(美国600 MHz)，核磁测试中TMS作为我们的指定内标物，测试核磁时全部采用氘代试剂.荧光测试时使用LS-55荧光分光光度计进行测试(美国Perkin-Elmer公司)；质谱测试时使用质谱用1260-6224 LC-MS TOF(安捷伦液相色谱质谱联用测试仪)进行检测.

1.2 合成过程如Scheme1所示，氮气保护下，将4-二乙氨基水杨醛(0.96 g，5 mmol)溶解在10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下持续搅拌直到4-二乙氨基水杨醛完全溶解，等到溶液澄清之后立即加入咪唑(0.544 g，8 mmol)，室温下继续搅拌半个小时，最后加入TBDMSCl(1.2 g，8 mmol)，油浴升温至60 ℃反应4 h.TCL监测待反应完成之后加入乙酸乙酯20 mL，然后用饱和氯化钠溶液连续洗涤有机相3次(30 mL×3)，用无水硫酸钠干燥有机相过夜，经过抽滤，减压旋蒸，最后将样品通过洗脱液石油醚/乙酸乙酯(V∶V=10∶1)经柱层析提纯得到最后产物棕色油状液体1.54 g，计算产率为78%.1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ=10.02(s,1H),7.61(d,J=8.00 Hz,1H),6.24(d,J=12.00 Hz,1H),5.88(s,1H),3.26～3.31(q,J=6.00 Hz,4H),0.93(s,9H),0.83(s,6H),0.19(s,6H);13C NMR(100 MHz,DMSO):δ=187.35,161.14,153.65,129.97,116.18,105.56,104.44,100.37,44.72,25.74,18.29,18.03,12.53,4.27.

Scheme 1 合成荧光探针分子A的路线过程图

探针分子A的合成：将2-苯甲酰基吡啶(0.8 g，4.37 mmol)，化合物1(1.98 g，6.5 mmol)，醋酸铵(1.7 g，21.9 mmol)溶解于30 mL冰乙酸中，回流反应7 h.反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，抽滤，得到大量固体产物，用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=4∶1)作为洗脱剂经柱层析提纯得到墨绿色晶体，产率为42%.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δ=8.14(d,J=12.00 Hz,2H),7.97(d,J=6.00 Hz,1H),7.88(d,J=12.00 Hz,1H),7.61～7.66(m,3H),7.43(t,J=6.00 Hz,1H),6.90(t,J=6.00 Hz,1H),6.65(d,J=6.00 Hz,2H),6.41(s,1H),3.53～3.57(m,J=6.00 Hz,4H),1.38(t,J=6.00 Hz,6H),0.92(s,9H);13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ=169.27,154.92,154.12,137.47,135.42,131.28,130.04,129.13,129.02,128.42,127.65,123.71,123.25,122.95,115.12,113.68,112.91,43.00,28.07,25.72,18.31,4.26;HR-MS(ESI):Calcd for C29H37N3OSim/z[M+H]+472.2706，Found 472.120 8.

2 结果与讨论

2.2 荧光探针A的选择性分析对于荧光探针分子A的选择性，我们取12份1.5 mL的探针分子A的四氢呋喃溶液(2×10-5mol/L)，把其中一份设置成空白样品，在剩下的11份探针分子A的四氢呋喃溶液中，同样分别加入1.5 mL的2×10-4mol/L的11种常见的阴离子PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-).关于探针分子A的裸眼识别部分，首先在肉眼下观察，如图1所示，可以看到当只有加入F-之后样品瓶中的溶液颜色才变为黄绿色，剩下的样品瓶中的颜色则为墨绿色.通过将样品瓶放置于365 nm紫外灯下照射，可以得到图2所示结果，加入F-之前的样品瓶中的荧光为青色，而当加入F-之后荧光发生变化，变为黄绿色.进一步探究探针分子A的选择性分析，我们取12份1.5 mL 2×10-5mol/L的探针分子A的四氢呋喃溶液，同样把其中一份设置为空白样品，在剩下的11份探针分子A的四氢呋喃溶液中，分别加入1.5 mL 2×10-4mol/L的11种常见阴离子的PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-)，通过荧光分光光度计分别进行扫描测试最后得到选择性分析图，如图3所示，可以知道探针分子A对氟离子具有很高的选择性识别能力.

图1 探针分子A在不同离子下的比色变化图

图2 探针分子A在不同离子下的荧光变化图

图3 在THF/PBS buff(V∶V=1∶1)体系下探针分子A对F-的选择分析图

2.3 荧光探针A的抗干扰能力分析为了探究探针分子A对氟离子的识别能力是否容易受到体外环境中离子的干扰，我们接下来进行了探针分子A的抗干扰实验，干扰离子均是常见的Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、NO3-、AcO-、SO42-、H2PO4-、CN-等，通过配置不同浓度的常见离子PBS buffer溶液和探针分子A的四氢呋喃溶液，保证在我们的测试体系当中(THF/PBS=1∶1)探针分子A的当量∶氟离子的当量∶干扰离子的当量为1∶10∶100.首先我们分别量取1 mL探针分子A的四氢呋喃溶液11份，将其中一份设置为空白样品，加入PBS buffer溶液1 mL，分别向剩下的10份样品中加入等体积100当量的不同干扰离子溶液，用荧光分光光度计然后进行荧光强度扫描测试.同上，我们同样取11份等体积的探针分子A的四氢呋喃溶液，设置一份空白样，向其中加入0.5 mL PBS溶液，再向其中剩下的10份样品瓶中分别加入等体积不同的干扰离子溶液，最后向每一份中样品瓶中加入0.5 mL 的氟离子PBS buffer溶液，再次通过荧光分光光度计进行扫描.如图4所示，结果表明探针分子A对氟离子的识别效果在存在100当量浓度的干扰离子之下依旧表现出十分优良的检测抗干扰性能.

图4 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)体系下探针分子A对F-识别的荧光强度干扰试验图

2.4 荧光探针A的滴定分析在THF/PBS=1∶1体系中，我们配置了6份1.5 mL的荧光探针分子A的四氢呋喃溶液，测试时我们分别向其中加入不同当量浓度的氟离子的四氢呋喃溶液(0～1 eq，其中1 eq代表2.0×10-5mol/L，下同)，然后通过对不同的氟离子当量浓度下的荧光探针分子A进行荧光图谱扫描测试，最后可以得到如图5所示的荧光探针分子A荧光强度随着波长变化的荧光发射图谱，可以看到随着氟离子当量的逐渐加入，整个体系的最大发射波长发生了红移现象，并且很明显的看到探针分子A的荧光强度在不断的降低，当加入的氟离子含量达到1 eq时，我们整个体系的荧光强度已经达到最低数值，继续增加离子的当量浓度，发现荧光强度基本不发生改变，结果表明氟离子与荧光探针分子A是按照1∶1的比例进行反应.为了计算得到荧光探针分子A对于氟离子的检测限(DL)，我们通过origin对不同氟离子当量浓度下的最大荧光发射强度进行一维线性拟合，如图6所示，整个体系拟合的线性回归方程是y=-233.152 5x+288.1，之中y表示最高荧光发射峰所代表的荧光强度数值，x则是为F-的当量浓度数值，整个一维线性拟合得到的相关系数R2为0.994 67，按照IUPAC检测限(DL)计算公式，DL=3σ/K[14-15]算得检测限为4.26×10-8mol/L，这说明探针分子A对F-具有较低的检测限.

图5 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)体系下探针分子A对F-的滴定分析图谱

图6 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)体系下探针分子A的荧光强度与F-浓度的线性关系图

2.5 荧光探针A的响应时间传感器的响应时间作为能否有更大应用价值的参考因素之一.在加入氟离子之后用LS-55荧光分光度计对探针分子A的溶液进行循环扫描测试，最后得到如图7所示结果.可以看到探针分子C对氟离子的响应非常快，响应时间仅需40 s.

图7 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)体系下探针分子A对F-的响应时间

3 识别机理分析

通过比较氟离子加入前后的质谱峰，可以进一步说明荧光探针分子A识别氟离子的机理，四丁基氟化铵被我们加入到探针分子A的溶液中，并且进行高分辨率质谱测试,如图8结果显示探针分子A与四丁基氟化铵混合后在356附近出现了一超强峰.我们推测该峰是[C23H22N3O]的碎片峰(探针分子A的相对分子质量减去含硅部分的相对分子质量刚好是356).该结果验证了探针分子A氟离子的识别作用是基于氟离子切断硅氧键这一机理,与已有文献[16]报道相吻合.

图8 探针分子A(a)及其与四丁基氟化铵混合后(b)的质谱图

图9 探针分子A对F-识别机理图

4 结论

在本次实验中，我们以苯甲酰基吡啶和4-二乙氨基水杨醛成功合成出荧光探针分子A的母体，在母体的基础上叔丁基二甲基氯硅烷被我们采用作为识别氟离子的位点，最后通过合理的设计合成出了一种基于硅氧键断裂为识别机理的荧光探针分子A，通过进一步的测试我们发现荧光探针分子A对氟离子识别表现出高选择性、高灵敏度的特点.此外荧光探针分子A还可以实现对氟离子的裸眼识别，通过比较探针溶液加入氟离子的前后，我们发现在裸眼状态下探针溶液的颜色，由氟离子加入之前的墨绿色变成氟离子加入之后的黄绿色；此外我们通过观察在365 nm紫外灯下探针溶液加入氟离子的前后的裸眼荧光变化，发现在裸眼状态下探针溶液的荧光由氟离子加入之前的青色变为氟离子加入之后的黄绿色.经过进一步荧光分光光度计检测荧光探针分子A的性能，结果表明荧光探针分子A可以很好地识别选择氟离子和表现出很好的抗干扰能力，检测限达到了DL=4.26×10-8mol/L，并且对氟离子的识别十分迅速，响应时间只有40 s.