牛源皮特不动杆菌对小鼠的致病性分析

樊利虹，郭红瑞，吴 江，易 军，马晓平，苟丽萍，谢 跃，叶 刚，左之才，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 温江 611130；2.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

供试的5株皮特不动杆菌分别于2018年7月分离自四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7菌株)、宜宾(ZZCJL1807-8菌株)、什邡(ZZCSF1807-9菌株)发生BRDC的肉牛鼻拭子。发病牛临床表现为体温升高(达41 ℃)，流鼻液，呼吸困难，口有泡沫，部分牛有口腔溃疡等症状，但蹄部、关节等无异常，有环丙沙星、阿莫西林、青霉素、头孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板蓝根等用药史，但病情总是反复。

1.1.2 主要试剂与配置

营养肉汤(NB)、革兰氏染色液、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色剂，购自北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司；PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.4)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；BM 2000+DNA marker、2×TaqPCR MasterMix，购自北京博迈德生物技术有限公司。

普通营养琼脂培养基(NA)：分别称取1.8 g NB、1.5 g琼脂粉，加100 mL双蒸水(ddH2O)，高压蒸汽灭菌后使用。

4%多聚甲醛：称取多聚甲醛40 g，加PBS磷酸盐缓冲液500 mL，置于50 ℃水浴锅加热搅拌至完全溶解，待冷却后加PBS磷酸盐缓冲液定容至1 000 mL，最后调节pH值至7.4左右。

1.1.3 试验动物

选用健康的4～5周龄、体重18～20 g的雄性SPF级昆明小鼠78只作为试验对象。试验动物均购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 毒力基因检测

将5株皮特不动杆菌分别接种于TSB中，37 ℃培养24 h后，按照细菌基因组提取试剂盒的说明书提取基因组DNA。ompA、bfmS、kpsMTⅡ、cnf1、cnf2、bap、epsA、plcD、lpxM、feoA、blaPER-1等11种毒力基因的检测均采用PCR法，引物序列和反应条件均参照文献[14-15]，并总结于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 皮特不动杆菌毒力基因检测的PCR引物序列Table 1 Primers sequence of virulence gene of Acinetobacter pittii

1.3 小鼠致病性试验

1.3.1 菌液制备

gyrB基因序列同源性分析和MLST分型结果显示，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7和ZZCJL1807-8菌株为同一序列型。基于此，选择菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9用于小鼠致病性试验。将2株菌的纯培养物接种于TSB中，37 ℃、200 r·min-1培养24 h后，采用平板计数法测定2株菌的菌落形成单位(CFU)，计算稀释前菌液的浓度(CFU·mL-1)。

1.3.2 动物分组与细菌接种量

根据预试验结果，将小鼠随机分为2组，每组分为6个浓度梯度，每个梯度6只，分别给不同组别小鼠注射0.2 mL相应浓度的菌液(攻菌组)，对照组6只小鼠采用同样方式注射等体积的NB。攻菌组和对照组小鼠饲养条件(饲料、饮水等)相同，隔离饲养。

1.3.3 临床症状观察与LD50测定

感染细菌后24 h内，每隔2 h观察一次小鼠的发病情况、精神状态和外观体况；感染24 h后，每天观察一次，连续观察7 d，并详细记录不同组别中小鼠的死亡数量。根据小鼠死亡情况，采用改良寇氏法计算菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9对SPF级昆明小鼠的LD50。

1.3.4 组织病理学检查

及时剖检死亡小鼠，无菌采集攻菌组和对照组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官，置于4%的多聚甲醛内(多聚甲醛体积为组织样品体积的10～15倍)，固定24 h以上，送成都里来生物科技有限公司制作病理切片，并对所制作的切片进行显微镜观察。

1.3.5 器官载菌量分析

无菌取病死小鼠的肝、心、脾、肺、肾和脑等器官，先用微量电子天平称量质量，然后放置于预冷的玻璃研磨器中，加入1 mL无菌预冷PBS磷酸盐缓冲液一起研磨，将匀浆加入无菌EP管中，再加入2 mL无菌预冷PBS磷酸盐缓冲液将研磨器中的部分残渣冲洗下来，然后进行10倍的梯度稀释。吸取各浓度匀浆液100 μL，接种于NA中37 ℃孵育24 h，记录培养基表面的单个菌落数，计算载菌量。

2 结果与分析

2.1 毒力基因检测结果

供试的5株牛源皮特不动杆菌中，bap(图1-A)、plcD(图1-B)、lpxM(图1-C)和feoA(图1-D)基因的检测结果均为阳性；菌株ZZCSF1807-9中ompA基因(图1-E)的检测结果为阴性，其余4株菌为阳性；epsA基因仅在ZZCSF1807-9中检测结果为阳性(图1-F)；其余毒力基因的检测结果均为阴性。

2.2 临床症状与死亡情况

接种ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9菌株的小鼠，8 h后均开始出现精神沉郁、饮食欲降低、扎堆畏寒等现象(图2-A)；10 h时，部分小鼠出现被毛紊乱，并伴有呼吸频率加快、眼眶发炎症状(图2-B)；12 h时，攻菌组小鼠开始出现死亡现象，且较高剂量组小鼠在感染12～24 h内全部死亡。试验期间，对照组小鼠健康状况良好，未出现死亡现象。

采用改良寇氏法计算得知，菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9的LD50分别为4.487×107CFU·mL-1和3.177×108CFU·mL-1。感染剂量与死亡率的统计结果详见表2。

表2 供试菌株对SPF级昆明小鼠的感染试验结果Table 2 Test result of strains to SPF Kunming mice

2.3 病理学观察

剖检死亡小鼠，ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9攻菌组小鼠均出现皮下充血、肠道积气积液现象，且接种菌株ZZCNC1807-6的小鼠肺中淤血现象较接种ZZCSF1807-9的小鼠严重，其余实质器官(肝、肾、心、脾、脑)未见明显眼观病理变化(图3)。

2.4 组织病理学观察

如图4所示：ZZCNC1807-6攻菌组小鼠肺间质明显增宽，其中有少量炎性细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)浸润，肺泡壁毛细血管充血，血管内可见少量白细胞和白细胞边缘化；肝淤血，肝细胞肿胀，发生空泡变性，可见少数肝细胞坏死，中央静脉血管内较多白细胞和淋巴细胞边缘化；脾充血、出血，脾白髓区可见淋巴细胞变性坏死，见胞核碎裂，周围少量纤维增生；心、肾未见明显病理变化。ZZCSF1807-9攻菌组小鼠肺间质明显增宽，其中有少量炎性细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)浸润，肺泡壁毛细血管充血，血管内可见少量白细胞和白细胞边缘化；肝细胞肿胀，肝中少量中性粒细胞浸润，中央静脉内少量白细胞边缘化；脾白髓部分脾小结细胞变性坏死，见胞核碎裂，周围少量纤维增生，红髓未见明显淤血和炎性细胞浸润；心、肾未见明显病理变化。

2.5 小鼠各器官细菌定殖情况和载菌量

无菌采集死亡小鼠各器官划线培养，ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9攻菌组小鼠均分离到与试验菌株培养特性、革兰氏染色形态相同的细菌(图5、图6)，经16S rDNA和gyrB基因测序比对，从小鼠各器官中分离到的细菌与所接种的试验菌株一致；对照组小鼠各器官中未分离出细菌。

小鼠器官载菌量分析结果(表3)显示，2株皮特不动杆菌对小鼠肝、心、脾、肺和肾的侵袭力差异不大，但ZZCNC1807-6对小鼠脑部的侵袭力强于ZZCSF1807-9。

表3 ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9菌株接种小鼠各脏器的载菌量Table 3 Bacterial load in various organs of mice inoculated with ZZCNC1807-6 and ZZCSF1807-9 CFU·g-1

3 讨论

近年，皮特不动杆菌在医院内的分离率越来越高，仅次于鲍曼不动杆菌[16]。然而，关于皮特不动杆菌与动物疾病相关的报道较少。现有报道中该菌主要引起水生动物患败血症或菌血症[17]，也有报道称该菌可能与犬、猫的呼吸道疾病有关[18]。Li等[19]和Malick等[17]研究发现，皮特不动杆菌感染武昌鱼和鲮鱼后，可致其出现鳞片脱落、腹水、皮肤溃烂、尾鳍腐烂等败血症症状，组织病理学观察均可见肝脏空泡变性。Wang等[20]报道，皮特不动杆菌可致泥鳅出现精神沉郁、嗜睡、食欲下降、皮肤黏液脱落、全身多处淤血等临床症状，剖检可见腹水、肝脏充血等病变。但目前关于皮特不动杆菌引起畜禽动物感染发病的报道极少，仅少量报道从家兔体内[21]和部分家畜寄生虫体内[16]检测到该菌，且未见皮特不动杆菌对小鼠致病性的研究报道。

本试验对5株牛源皮特不动杆菌进行了毒力基因检测，结果显示，5株菌均携带有参与生物膜形成的bap基因、侵袭性毒力因子plcD、对不动杆菌拮抗阳离子肽和干燥环境起关键作用的lpxM基因和具有铁摄取能力的feoA基因。其中，ZZCSF1807-9的ompA基因检测结果为阴性，另4株菌为阳性；ZZCSF1807-9含有免疫逃逸作用的epsA基因，而其余4株菌未携带该基因。以上现象的出现可能与来自不同地区的菌株毒力强弱差异有关。小鼠致病性试验中，菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9腹腔感染小鼠后，可在较短时间内致小鼠出现精神沉郁、被毛紊乱、呼吸频率加快、眼眶发炎等症状，并在24 h内出现死亡，但其LD50差异较大。从试验结果判断，ZZCNC1807-6的毒力强于ZZCSF1807-9。剖解死亡小鼠可见，皮特不动杆菌主要造成小鼠皮下充血、肺淤血肿胀和肠道积气积液，且ZZCNC1807-6攻菌组小鼠的肺病变较ZZCSF1807-9攻菌组严重，其余器官中并未观察到明显眼观病变。组织病理学观察结果显示，该菌对小鼠机体的损伤主要表现在肝和肺中有少量炎性细胞浸润，脾中白髓细胞坏死和纤维增生，且ZZCNC1807-6攻菌组小鼠的病变较ZZCSF1807-9攻菌组相对严重。但2组小鼠的组织病变均较轻微，可能是由于小鼠是在短时间内发生急性死亡的，各器官还未发生明显病变。同时，细菌定殖情况和载菌量分析显示，皮特不动杆菌不仅可感染肝、心、脾、肺、肾等多种内脏实质器官，还可透过血脑屏障感染脑部，引起脑膜炎等疾病，导致小鼠死亡。

综上，分离于BRDC发病牛鼻拭子的皮特不动杆菌对小鼠具有较强的致病性，表明该菌可能为肉牛呼吸道感染的主要致病菌或继发感染病原菌。不同菌株毒力强弱具有差异性，可能与不同地区的菌株感染来源有关。本试验的研究结果丰富了皮特不动杆菌对动物的致病性研究资料，也为深入研究该菌的致病机理奠定了试验基础。