蟾酥酒制对蟾蜍甾烯含量变化及透皮吸收的影响

李丹丹 ，陈吴越 ，周昊言，吕 翔，周 婧∗，马宏跃∗，王恒斌，狄留庆，段金廒

（1.南京中医药大学，江苏省方剂高技术研究重点实验室／江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京 210023；2.雷允上药业集团有限公司，江苏苏州 215009）

动物药蟾酥含有复杂的化学成分，包括蟾蜍甾烯类、蟾毒色胺类、吲哚生物碱类、甾醇类以及氨基酸、多肽类等成分［1-3］。现代药理学研究表明蟾酥及其活性成分具有抗肿瘤［4-5］、强心［6］、镇痛［7］、抗菌［8］及抗炎［9］等作用，临床常用于恶性肿瘤、心血管等疾病治疗［10-11］。除了口服使用外，蟾酥外用治疗癌痛、疮疡、皮肤感染、带状疱疹疼痛、牙痛等［12-13］，历史悠久，特色鲜明，疗效出众。

蟾酥药材多为片酥，临床调剂或者成药制剂前，需要进行炮制（或粉碎）处理。传统炮制方法［14］，包括宋代铁上焙焦（《太平圣惠方》 ）、酒炖（《妇人良方大全》 ）；明代有汤浸（《普济方》 ）、乳汁制等。目前2020 年版《中国药典》（一部）规定蟾酥粉炮制方法为酒制［15］，取蟾酥，捣碎，加白酒浸渍，时常搅动至呈稠膏状，干燥，粉碎。每10 kg 蟾酥，用白酒20 kg［16］。片酥质地坚硬，粉碎困难，古代酒制的主要目的是便于片状蟾酥粉碎，随着现代科技的发展，实际生产中由于酒制方法繁琐，常使用打粉机进行粉碎处理。蟾酥酒制除了便于粉碎外，是否还具有其他方面的功用，目前尚未知晓。考虑到蟾酥中甾烯类成分具有较好的脂溶性，相比水溶性物质更容易透皮吸收，是蟾酥外用的重要功效物质。前期课题组对商品蟾酥含量测定结果显示脂蟾毒配基、沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基是市售药材及饮片中含量较高的成分。但目前对这几种蟾蜍甾烯类成分在酒制前后含量变化的研究缺乏一定的系统性。且鲜有对蟾酥酒制前后甾烯成分外用透皮吸收的研究。本实验选择蟾酥中6 种含量较高且具活性的蟾蜍甾烯成分为指标，采用HPLC 法对酒制前后该类成分进行定量分析，并通过体外Franz 扩散池法测定酒制前后其透皮吸收比率，探究酒制对蟾酥中蟾蜍甾烯类成分的影响，以期为蟾酥炮制提供科学依据。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；TK-12D 型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）。对照品蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基实验室制备，纯度＞98.0%；沙蟾毒精（180427）、华蟾毒它灵（180318）、蟾毒它灵（180419），纯度均＞98.0%，均购于北京普天同创生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，购于德国Merck 公司。24 批蟾酥药材购自全国不同产地（江苏、安徽、山东、吉林、重庆），经南京中医药大学药学院马宏跃教授鉴定为蟾蜍的干燥分泌物。

实验动物，雄性豚鼠，体质量250～300 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号SCXK（苏）2017-0011。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵对照品粉末适量，加入甲醇制备成质量浓度为10 mg／mL 的对照品贮备液。取适量贮备液，逐级稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液，4 ℃下离心（14 000 r／min）20 min，取上清。

2.1.2 样品溶液 精密称定蟾酥粉末（过24 目筛）15 mg，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液定容，称定质量，超声提取1 h。放冷，再称定质量，用甲醇溶液补足减失的质量，摇匀后，4 ℃下离心（14 000 r／min）20 min，取上清，经0.22 μm 微孔有机滤膜过滤，即得。

2.2 酒制样品溶液 根据2020 年版《中国药典》规定，参照袁旭江等［17］正交优化后的蟾酥酒制工艺进行炮制，蟾酥打粉（过24 目筛）后加入白酒（红星二锅头，20180916）60 ℃下浸渍12 h（蟾酥和白酒比例为1 ∶2），搅拌至稠膏状，80 ℃干燥后粉碎，按“2.1.2”项下方法制备蟾酥酒制品溶液。

2.3 体外透皮实验 将实验豚鼠处死后，8%硫化钠脱毛，剥离豚鼠皮肤并除去皮下脂肪、血管，生理盐水冲洗，冷藏备用，实验前检查皮肤完整性。采用TK-12D 药物透皮扩散仪研究蟾酥的透皮吸收。接收池中含有10% 乙醇的生理盐水。接收池用磁力搅拌器在以（37 ± 0.5）℃，以400 r／min 匀速搅拌。在给药60 min 后，取下给药区域皮肤，用10%乙醇洗去皮肤表面药物残留。将皮肤磨碎，甲醇超声提取，离心取上清液过膜，测定皮肤内渗入的蟾酥甾烯含量。

2.4 色谱条件 色谱条件参照《蟾酥商品药材的品质评价及质量标准草案建立》［18］中优化条件，采用Waters XBridge C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2% 磷酸水（B），梯度洗脱（0～6 min，20%～25% A；6～12 min，25%～30% A；12～24 min，30%～35% A；24～34 min，35%～40% A；34～35 min，40%～90% A；35～37 min，90% A；37～38 min，90%～20% A；38～42 min，20% A）；柱温35 ℃；体积流量0.7 mL／min；检测波长296 nm。

3 实验结果

3.1 蟾酥酒制前后特征图谱分析 取蟾酥供试品溶液（S1～S24）、蟾酥酒制品供试溶液（J1-J24），通过液相色谱进样分析，将各批次蟾酥色谱图、蟾酥酒制品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）。以S1 为参照图谱，时间窗设为0.1 s，采用中位数法生成对照图谱。由图1 可知，蟾酥和蟾酥酒制品HPLC 特征图谱基本一致，二者均具有16 个共有峰，但部分化学成分峰面积存在一定差异，即质量有所不同。

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察 取“2.1.1”项下稀释不同倍数的混合对照品溶液，在“2.4”项条件下进样，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

3.2.2 精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，在“2.4”项条件下进样6 次，测得沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基RSD 分别为0.24%、0.71%、0.40%、0.36%、0.29%、0.42%，表明仪器精密度良好。

3.2.3 重复性试验 取样品TJ-2 粉末6 份，按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，在“2.4”项条件下进样，测得沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基RSD 分别为 1.46%、0.74%、1.39%、0.45%、0.45%、0.46%，表明该方法重复性良好。

3.2.4 稳定性试验 取样品TJ-2 粉末，按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，在“2.4”项条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基RSD 分别为0.72%、2.33%、0.31%、0.49%、0.36%、0.47%，表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.2.5 加样回收率试验 精密称取6 份TJ-2 粉末，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备溶液，在“2.4”项条件下进样，测得沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基加样回收率（RSD）分别为100.54%（3.10%）、103.34%（2.90%）、99.75%（3.61%）、102.03%（2.56%）、98.72%（1.57）%、101.19%（2.14）%。

3.3 酒制前后样品含量测定 在“2.4”项条件下，HPLC-UV 含量测定结果见图2，24 批蟾酥中6种蟾蜍甾烯的平均质量分数为14.39%，酒制后平均质量分数为13.87%，下降率3.62%。蟾酥经过酒制后，6 种蟾蜍甾烯类成分的质量分数略有下降，下降比率从1.63%～7.29%。下降比率接近或大于5%的分别是沙蟾毒精和脂蟾毒配基。

图2 24 批蟾酥酒制前后6 种甾烯含量测定结果Fig.2 Results of content determination of six bufadienolides in twenty-four batches of toad venom before and after processing

3.4 蟾酥酒制前后对体外透皮吸收的影响 蟾酥酒制前后体外透皮吸收结果见表2，结果表明，与蟾酥相比，酒制蟾酥后6 种蟾蜍甾烯类成分的透皮吸收率均有所下降，其中沙蟾毒精和脂蟾毒配基下降率最大，分别为26.19%、20.72%。

4 讨论

蟾酥临床用药前需要进行炮制处理。2020 年版《中国药典》 中规定蟾酥用酒进行炮制。参考以往酒制工艺研究结果，本实验确定的酒制法操作为蟾酥打粉后加入白酒，60 ℃下浸渍12 h（蟾酥和白酒比例为1 ∶2），搅拌至稠膏状，80 ℃干燥后粉碎。

通过对蟾酥及酒制蟾酥HPLC 特征图谱进行比较，发现两者在色谱峰数量上没有差异，在峰面积方面略有差异。含量分析表明，蟾酥酒制后6 种甾烯成分含量均有下降，影响最大的为沙蟾毒精和脂蟾毒配基。体外透皮实验发现，酒制后各甾烯成分透皮吸收率有所下降，对沙蟾毒精和脂蟾毒配基影响较大。蟾酥作为成分复杂的动物药，含有复杂的蛋白多肽类成分，推测可能是由于蟾酥中其他成分如多肽类成分在酒制后发生变化从而影响其透皮吸收。

表2 蟾酥中6 种蟾蜍甾烯类成分酒制前后质量变化及透皮吸收率的变化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

表2 蟾酥中6 种蟾蜍甾烯类成分酒制前后质量变化及透皮吸收率的变化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

总的来说，片酥质地坚硬，粉碎困难，酒制的主要目的是便于片状蟾酥粉碎。同时蟾酥甾烯过量摄入有潜在心脏毒性，酒制对于减低蟾酥的毒性有积极意义。本实验考察了蟾酥酒制对药材中6 种甾烯成分含量以及透皮吸收比率的影响，酒制后，一方面小幅降低甾烯的含量；另一方面，通过使蟾酥中蟾毒蛋白变性，总体上提高了药材的安全性。