速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌损伤相关蛋白表达的影响

陈 琳，张 艳，陈 勇*

1.湖北大学 药物高通量筛选技术国家地方联合工程研究中心，湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室，湖北 武汉430062

2.湖北中医药大学检验学院，湖北 武汉 430065

速效救心丸由川芎、冰片等组成，具有扩张冠状动脉、舒张血管平滑肌、抗心肌缺血、保护心肌细胞、抑制粥样动脉形成、降低血黏度、解痉镇痛等作用，临床常用于治疗气滞血瘀型冠心病和心绞痛[1-3]。研究发现，速效救心丸可改善动脉粥样硬化大鼠脂质代谢紊乱，抑制血管的氧化应激与炎症反应，逆转早期粥样斑块的形成[4-6]；可抑制动脉粥样硬化大鼠主动脉管壁基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受体CXCR4 的表达，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[7]；可调节ApoE缺陷小鼠心肌组织金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制因子蛋白表达的平衡，增加动脉粥样硬化斑块的稳定性[8]。此外，速效救心丸可缓解氧化损伤，扩大冠脉血流量，减少心肌耗氧量，抑制犬心肌梗死面积[9]；缺血损伤导致心肌细胞线粒体膜上细胞色素C氧化酶亚基6A2、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）和磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基α mRNA 表达水平显著降低，腺苷酸环化酶mRNA 表达水平显著升高，速效救心丸可显著逆转心肌细胞上述指标mRNA 表达水平，改善心肌细胞功能[10]；速效救心丸可抑制线粒体通透性转换孔的开放，保护线粒体膜功能的完整性，减少细胞色素C 的释放，降低缺血/再灌注对大鼠心肌细胞的凋亡作用[11]，也可通过调节磷脂肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/GSK3β 通路，抑制低氧诱导的细胞凋亡[12]；速效救心丸可抑制急性冠脉综合征患者炎症反应，降低血浆纤维蛋白原水平与血小板聚集率，改善病人血管重建术后的临床症状[13-14]。目前速效救心丸改善心肌缺血的作用机制尚不明确，本研究探讨了速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌组织中缺血损伤相关调控蛋白表达的影响，为阐明其改善心肌缺血的作用机制提供参考。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠50 只，6 周龄，体质量（150±10）g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK（鄂）2015-0018。动物分笼饲养于湖北大学生命科学学院SPF 级动物房，12 h 交替光照，自由饮水摄食，饲养温度（22±2）℃，相对湿度（65±5）%。动物实验经湖北大学伦理委员会批准（批准号20170601）。

1.2 药品与试剂

丙硫氧嘧啶（50 mg/片，批号160101）购自广东华南药业集团有限公司；速效救心丸（40 mg/粒，批号616154）购自天津中新药业集团股份有限公司；垂体后叶素（6 U/mL，批号160401）购自南京新百药业有限公司；高脂饲料（含10%蛋黄粉、2%胆固醇、10%猪油、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶、77.3%基础饲料）购自湖北省实验动物研究中心；RIPA 裂解液（批号P0013B）、蛋白酶抑制剂PMSF（批号ST506）、上样缓冲液（批号P0015）、抗体稀释液（批号010917170306）、化学发光液（批号040617170602）购自上海碧云天生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂Cocktail（批号15205300）、磷酸酶抑制剂（批号41659200）购自Roche 生物科技公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号SK258368）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；苏木素-伊红（HE）染液（批号G1005）购自谷歌生物科技公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、6-酮-前列环素F-1α（6-ketone-prostacycline F-1α，PGF-1α）和内皮素-1（endothelin 1，ET-1）血清检测试剂盒（批号为20170323）购自南京建成生物科技有限公司；鼠抗小鼠β-actin 单克隆抗体（批号SC-47778）购自Santa 生物科技公司；兔抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗体（批号F05142393）、兔抗大鼠ET-1 多克隆抗体（批号G01182780）、兔抗大鼠内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）多克隆抗体（批号G02251789）、兔抗大鼠低氧诱导因子-1α（hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）多克隆抗体（批号G02101607）、兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗体（批号G01230003）、兔抗大鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗体（批号15090820）购自沈阳万类生物科技公司；PVDF 膜购自Millipore生物科技有限公司；HRP 标记的羊抗兔及羊抗小鼠IgG 抗体（批号分别为10312942、10283379）购自KPL 生物科技有限公司。

1.3 仪器

iMARKTM 酶标仪（美国BIO-RAD 公司）；Pannoramic MIDI 病理切片扫描仪配分析软件Image-pro-plus 6.0（匈牙利3D Histech 公司）；5810R台式低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；DYC-40A型垂直电泳槽、电转仪（中国北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 心肌缺血模型的制备、分组与给药

小鼠ig 速效救心丸的半数致死量（lethal dose，LD50）为15.7 g/kg，折算成大鼠ig 速效救心丸的LD50为10.9 g/kg[15]。大鼠随机分为对照组、模型组及速效救心丸低、中、高剂量（250、500、1000 mg/kg，相当于大鼠LD50值的1/40、1/20、1/10）组，每组10 只。对照组以普通饲料饲养，其余各组以高脂饲料饲养24 周。速效救心丸混悬于0.5% CMC-Na，分别配制成质量浓度为25、50、100 mg/mL 的溶液。第24 周，各给药组ig 相应药物（10 mL/kg），对照组与模型组ig 0.5% CMC-Na 溶液，1 次/d，连续7 d。给药第5 天，模型组与各给药组ip 垂体后叶素（30 U/kg），1 次/d，连续3 d[16]。最后一次ip 垂体后叶素后，腹主动脉取血，分离血清备用；大鼠脱颈椎处死，心脏灌流后取心脏组织。

2.2 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌组织病理变化的影响

心脏组织固定于多聚甲醛中24 h，依次用梯度乙醇脱水，经无水乙醇和二甲苯处理10 min 使组织透明；浸蜡处理1 h，用包埋机进行包埋，并切成5 μm 厚度的切片；于40 ℃水浴展开切片并负载于防脱载玻片，于60 ℃烘干后依次经苏木素染色8 min和伊红染液染色2 min，最后用中性树胶封片。于显微镜下观察并拍照。

2.3 速效救心丸对心肌缺血大鼠血清关键指标的影响

按照试剂盒说明书测定大鼠血清中CK-MB、TXB2、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平。

2.4 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌关键蛋白表达的影响

心脏组织经液氮冷冻后敲碎，取50 mg 心脏组织加入500 μL RIPA 裂解液（含PMSF、Cocktail、磷酸酶抑制剂），4 ℃裂解30 min 后，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清液测定蛋白含量。取50 μg 心脏组织总蛋白加入适量上样缓冲液混匀，100 ℃变性处理10 min 后，于−80 ℃保存备用。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，室温封闭2 h，分别加入ET-1、VEGF、eNOS、HIF-1α、Akt、p-Akt、β-actin 抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（1∶1000），室温孵育1.5 h。加入化学发光液显色后暗室曝光，采用Image J 软件对蛋白条带进行扫描和定量分析。

2.5 统计分析

实验数据以±s表示，采用SPSS 软件对实验数据进行分析，对各组数据进行方差齐性检验后，进行各组数据间的t检验。

3 结果

3.1 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌组织病理变化的影响

如图1所示，对照组大鼠心肌细胞横切面呈圆形，细胞核位于细胞中间，形态结构正常。与对照组相比，模型组大鼠心肌细胞间质有充血和炎性细胞浸润现象，中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞增多，有少量红细胞漏出，表现出急性炎症反应；此外，模型组还存在明显的细胞萎缩，表现为细胞体积减少、细胞核变小、细胞间质水肿增宽，偶有细胞坏死与细胞核消失；合并心肌细胞横向断裂，提示存在心肌缺血损伤。与模型组相比，各给药组心肌细胞间质充血和炎性细胞浸润现象有所缓解，中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数量以及红细胞漏出较少；此外，细胞萎缩和细胞核变小的比例降低，细胞间质水肿增宽程度、细胞坏死、细胞核消失及心肌细胞横向断裂现象亦明显减少，速效救心丸高剂量组效果最佳。

图1 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌组织病理变化的影响 (HE,×100)Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on pathological changes of myocardiac tissues in myocardial ischemia rats model (HE,× 100)

3.2 速效救心丸对心肌缺血大鼠血清关键指标的影响

血清中CK-MB、cTnT、cTnI 水平是临床评价心肌缺血的重要指标，TXB2、PGF-1α、ET-1 水平是临床评价心肌梗死的重要指标。如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、TXB2、PGF-1α、ET-1 水平显著升高（P＜0.05），表明造模成功。与模型组比较，速效救心丸中、高剂量组大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平均显著降低（P＜0.05），高剂量组大鼠血清中TXB2水平显著降低（P＜0.05），表明速效救心丸可有效降低模型大鼠发生心肌缺血与梗死的风险。

3.3 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌关键蛋白表达的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠心脏组织中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt 和eNOS 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，速效救心丸高剂量组心脏组织中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt和eNOS 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；中剂量组心脏组织中HIF-1α、ET-1 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），p-Akt/Akt 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；低剂量组心脏组织中ET-1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。表明速效救心丸能改善心肌缺血对上述关键蛋白表达的影响。

表1 速效救心丸对心肌缺血大鼠血清关键指标的影响 (x s,n=6)Table 1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on myocardial ischemia-related key serum indexes in myocardial ischemia rats model(x s,n=6)

图2 速效救心丸对心肌缺血大鼠心肌关键蛋白表达的影响 (x s,n=3)Fig.2 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on expression of myocardial ischemia-related proteins in myocardiac tissues of myocardial ischemia rats model (x s,n=3)

4 讨论

CK-MB 主要分布于心肌，心肌损伤可触发其释放进入细胞外液，提升其血清水平，是早期临床诊断缺血再灌注损伤的标志物，但特异性不高[17]。心肌肌钙蛋白仅存在于心肌，包括T、I、C 3 种亚基，cTnT 和cTnI是主要的心肌损伤标志物。血清中cTnT和cTnI 水平主要用于急性心肌梗死的诊断、不稳定型心绞痛的预后判断等，已成为临床上心肌梗死诊断的金标准[18]。血清中TXA2、PGI2水平升高易导致血小板聚集与血栓形成，但二者稳定性差，通常检测其稳定代谢物TXB2和PGF-1α 的水平[19]。ET-1 参与调节血管收缩、血管重塑、血管生成和细胞外基质合成，其血清水平是判断冠心病心绞痛严重程度的重要指标[20]。研究结果显示，速效救心丸可显著降低心肌缺血大鼠血清中上述指标水平，且呈剂量相关性。结合心脏组织病理切片结果，表明速效救心丸对心肌缺血损伤具有明显预防作用。

VEGF 与血管生成、血管通透性密切相关[21]。低氧、低氧预适应是诱导VEGF表达的重要原因[22]，HIF 通路和PGC-lα 通路是低氧介导VEGF 形成大脑新血管的重要通路[23-24]。HIF 是低氧反应的中心介质，其中HIF-1 对缺血坏死后新生血管的形成和低氧诱导的细胞凋亡起关键调控作用[25]。HIF-1 由α、β 亚单位组成，其中α 亚单位是其特异性蛋白，对体内氧含量敏感，低氧能诱导HIF-1α 蛋白表达。VEGF 是HIF-1α 的重要靶点之一，脑缺氧后HIF-1α表达上调，诱导VEGF 蛋白表达，促进微循环重建，增加缺血组织血流灌注和供氧量[26]。内皮细胞产生的NO和ET-1对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用，其表达异常是引起心肌缺血等心血管疾病的重要因素[27-28]。VEGF 可通过活化磷脂酶Cγ 促进前列腺素的生成，提高血管通透性；也可作为eNOS 的上游激活物，通过Akt 促进一氧化氮（nitric oxide，NO）合成与内皮细胞增生，增加细胞通透性[29]。研究表明，PI3K/Akt 信号通路的激活是缺血后机体的保护机制之一，eNOS 是该途径的下游靶点[30]。在内皮细胞中，VEGF 可通过激活NO 下游效应物PI3K、Akt 和eNOS，从而调控NO 的生成[31]。NO 和HIF-1 信号通路间高度串扰[32]，如在活化的巨噬细胞和近端小管细胞共培养系统中，NO 可调节缺氧及炎症下的HIF-1α 累积反应[33]，HIF-1 可通过诱导心肌细胞中诱导型一氧化氮合酶和细胞色素C 氧化酶亚单位4-2 mRNA 和蛋白表达水平，同时降低eNOS mRNA 和蛋白表达水平，协同调控NO 的生成[34]。HIF-NO 信号通路对减少缺血再灌注诱导的氧化损伤和梗死面积有着重要作用[35-36]。

如图3所示，心脑缺血相关蛋白VEGF、HIF-1α、p-Akt、eNOS 与HIF-1 信号通路密切相关，且相互间调控关系密切。本研究发现，速效救心丸能够显著降低心肌缺血大鼠心肌HIF-1α、VEGF 和ET-1的蛋白表达水平，升高p-Akt 和eNOS 蛋白表达水平，呈剂量相关性，表明速效救心丸改善心肌缺血损伤的作用机制与其调控上述关键蛋白表达相关，且受HIF-1 信号通路调控。

图3 心脑缺血相关蛋白与HIF-1 信号通路的联系Fig.3 Relationship between cardiac and cerebral ischemia-related proteins and HIF-1 signaling pathway

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