数字PCR 技术及其在动物生产中的应用

洪奇华，陈学秋，金妙仁，胡彩虹*

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.杭州海尔希畜牧科技有限公司，浙江杭州 311261）

近20 年来，实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）技术已成为核酸分子定量的常规方法。qPCR 利用参照基因对起始样品进行相对定量，也可依赖于标准曲线实现对样品的绝对定量，但由于其计数分辨率有限，当靶核酸浓度较低、存在PCR 抑制剂干扰、扩增曲线的循环阈值（Ct 值）分辨不好时，qPCR 就不能满足严格的量化要求。而数字PCR（digital PCR，dPCR）技术采用“分而治之”的策略，不仅可以得到目标分子的浓度，还可以获得其绝对数目[1]。近年来，dPCR 技术凭借其高通量、高准确度、真正绝对定量等特点迅速发展起来，并在多个领域得到了极为广泛的应用。本文简要介绍了dPCR 技术的基本原理、主要优势和技术平台，并对其在动物生产中的应用进行了综述。

1 dPCR 的基本原理

dPCR 方法主要基于靶区的划分、单分子PCR 和泊松统计3 个要点，其检测原理与qPCR 基本相同，但在量化方式上有所不同。qPCR 反应在单一体系中进行，而dPCR 技术先将带荧光标记DNA 样品的反应体系进行稀释，分配到几百到几百万个不同的区室（如液滴和微孔）中，每个区室含有0、1 或多个DNA 模板分子，充当一个独立的PCR 微反应器；各反应室内DNA 分子独立进行常规PCR 反应，然后采集每个反应室的荧光信号，根据荧光信号的存在与否分别给出数字信号“1”或“0”的结果，代表目标DNA 的存在与否；最后通过泊松统计估计每个分区的平均分子数，然后除以分配体积换算成浓度，计算获得样本的原始拷贝数，从而实现对靶标分子的绝对计数（图1）[2-3]。……