高迁移率族蛋白B1沉默对人端粒酶逆转录酶抑制作用及其与肺癌放疗敏感性关系研究

徐 莹， 吕东阳， 任 雪， 阎 英， 李 玲

北部战区总医院1.放射治疗科；2.妇产科，辽宁 沈阳 110016

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]，放疗是肺癌的主要治疗手段[2]。然而，仍有部分患者放疗疗效不理想，出现肿瘤放射线抵抗。因此，对肺癌放射抵抗机制的研究成为了放疗领域的研究热点。人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)存在于90%的恶性肿瘤中，端粒是真核细胞染色体末端发现的一种特殊的DNA-蛋白质复合体，端粒稳态与放射敏感性密切相关，增加放射敏感性有助于控制肿瘤的生长速度[3]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是在哺乳动物中广泛存在的一种丰富的染色质相关蛋白，参与肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移，其高水平表达与临床预后不良相关[4]。有研究表明，HMGB1对hTERT活性没有影响，改变HMGB1的表达不会导致染色质结构的任何明显变化[5]。另有研究表明，HMGB1基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的沉默导致hTERT活性下降及端粒功能障碍，而HMGB1过表达则增强了hTERT活性[6]。目前，HMGB1基因沉默是否下调hTERT表达，以及是否提高肿瘤的放疗敏感性尚未清楚。本研究旨在探讨HMGB1沉默对hTERT的抑制作用，以及其与肺癌放疗敏感性的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 将肺癌细胞系(H-1299)和正常肺泡上皮细胞(BEAS-2B)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。根据处理方式不同将细胞分为对照组(无X射线照射，转染空白质粒)，HMGB1 KO组(转染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1)，KO+5 Gy组(转染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1，照射剂量5 Gy)，KO+10 Gy组(转染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1，照射剂量10 Gy)。

1.2 构建稳定转染的细胞系 选择针对HMGB1的人shRNA 5‘-GCTCAAGGAGAAT TTGTAA-3’，该序列与3’端结合作用最强，然后以与人类基因同源性有限且打乱的人shRNA序列5‘-GCTGGAGCAGTCCGATC-3’作为阴性对照。合成shRNAs，将其亚克隆至pGPU6/GFP/Neo shRNA载体，构建成重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体。将得到的载体命名为pGPU6/GFP/Neo-HMGB1和pGPU6/GFP/Neo-shNC。用600 g/ml G418筛选HMGB1低表达细胞和阴性对照细胞。稳定转染的细胞系分别命名为H-1299-shHMGB1和H-1299-NC。

1.3 细胞转染 用脂质体2000对人HMGB1 shRNA和阴性对照shRNA进行细胞转染，操作过程按说明书进行。将病毒浓缩液与食管癌细胞共培养，光学显微镜下观察细胞荧光，证实转染成功。序列如下：HMGB1-shRNA正义，5‘-GGGAGGAGCAUAA GAAGAATT-3’和反义，5‘-UUCUUCUUAUGCUCCUCCUCTT-3’，NC shRNA正义，5‘-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’和反义5‘-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4 细胞系培养与X射线照射 肺癌细胞系(H-1299)和H-1299-shHMGB1细胞系在RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素培养。细胞保存在CO2孵箱中(37℃，CO2浓度5%)。用6 MV西门子直线加速器照射肿瘤细胞，源皮距离100 cm，剂量220 Gy/min。

1.5 HMGB1 mRNA表达检测 从稳定转染的细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒在42℃下反应10 min，然后在95℃下反应2 min。根据Takara 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒说明进行重复PCR反应操作。样品在95℃预孵育30 s，然后95℃预孵育5 s，60℃预孵育15 s，72℃预孵育30 s。HMGB1：5‘-ATATGGCAAAA GCGGACAAG-3’和5‘-GCAACATCACCAATGGACAG-3’。β-肌动蛋白：5‘-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’和5‘-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3’。所有的操作均至少重复3次。热扩增在Mx3000P qPCR系统上进行，结果用MxP3000P分析程序进行分析。

1.6 蛋白免疫印迹法 每500 μl冷的裂解液中加入2 μl蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上备用。将组织剪碎匀浆后，用BCA蛋白测定试剂盒测蛋白浓度。进行转膜，将膜移至含有封闭液的平皿中，室温摇床上摇动封闭1.5 h。将一抗用PBST稀释至适当浓度，4℃孵育过夜后，用PBST在室温摇床上洗3次，每次10 min。添加二抗室温下孵育1.5 h后，用PBST在室温摇床上洗3次，每次10 min。进行化学发光反应。

1.7 噻唑蓝实验 将细胞接种于96孔板内，置于细胞培养箱内培养过夜，分别于0、24、48、72、96、120 h更换含5 μg/μl 噻唑蓝(MTT)溶液的培养液，加入DMSO震荡、溶解后，测定吸光度值。

1.8 划痕损伤实验 将进入对数生长期的细胞悬液放入六孔板中，用200 μl无菌枪头在每个孔中长满的单层细胞上划1～2道痕，在显微镜下观察划痕修复的过程，分别于0、24、36 h拍照记录，比较不同细胞损伤修复速度。

1.9 脂质体转染 以lipofectamineTM2000转染siRNA于24孔细胞培养板，室温孵育5 min。再用50 μl上述培养液稀释脂质体(LipofectamineTM2000)，孵育完毕后将脂质体-siRNA混合液加入24孔板内。培养6 h后，将24孔板里含有脂质体-siRNA混合液的培养基吸弃，48 h观察细胞功能。

1.10 Transwell实验 将基质胶与无血清培养液按1∶5比例稀释，吸取200 μl稀释后的基质胶溶液均匀铺在小室上室面，于细胞培养箱内孵育30 min。基质胶凝固后，向24孔板孔内加入500 μl含10% FBS的培养液，FBS作为趋化因子诱导细胞穿膜。将细胞制成单细胞悬液接种至小室内，将小室浸入4%的多聚甲醛溶液中固定10 min，结晶紫溶液染色5 min，显微镜下观察并拍照。

1.11 平板克隆实验 将细胞制成单细胞悬液，于细胞培养箱内37℃培养10 d，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色，PBS清洗，拍照后计数克隆数量。

2 结果

2.1 放疗对HMGB1表达影响 与正常肺泡上皮细胞BEAS-2B比较，HMGB1在肺癌细胞H-1299中表达显著上调(P<0.05，图1a)。10 Gy放疗48、96 h后，HMGB1均较对照组显著降低(P<0.05，图1b)。

图1 放疗对HMGB1表达影响(a.HMGB1蛋白在正常肺泡上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞H-1299中的表达；b.放疗对HMGB1蛋白表达的影响)

2.2 HMGB1沉默对H-1299细胞增殖的影响 MTT与细胞克隆形成实验结果显示，HMGB1沉默后，随着放疗剂量增加，H-1299细胞活力显著降低(P<0.05，图2)。

图2 HMGB1沉默对H-1299细胞增殖的影响(a.48 h MTT结果；b.96 h MTT结果；c～d.细胞克隆形成实验结果)

2.3 HMGB1沉默对H-1299细胞迁移及侵袭的影响 划痕实验结果显示，HMGB1沉默后，放疗剂量越大，H-1299细胞迁移所受影响越明显(P<0.05，图3a)。Transwell实验结果显示，HMGB1沉默后，随着放疗剂量增加，H-1299细胞侵袭能力显著降低(P<0.05，图3b)。

图3 HMGB1沉默对H-1299细胞迁移及侵袭的影响(a.划痕实验结果；b.Transwell实验结果)

2.4 HMGB1沉默对H-1299细胞细胞周期的影响 HMGB1沉默后H-1299细胞G1期减少，G2期增加；给予放疗后，细胞周期明显阻滞，G1期减少及G2期增加程度更明显。见图4。

图4 HMGB1沉默对H-1299细胞细胞周期的影响

2.5 HMGB1沉默对H-1299细胞凋亡的影响 HMGB1沉默后，随着放疗剂量增加，H-1299细胞凋亡率明显增加(P<0.05，图5)。

图5 HMGB1沉默对H-1299细胞细胞周期凋亡的影响

2.6 HMGB1沉默对hTERT相关信号通路的影响 HMGB1沉默导致hTERT、RFPL3、CBP、TRF1和TRF2蛋白表达均有不同程度的降低，而给予放疗后，这些蛋白的表达均显著降低(P<0.05，图6)。

图6 HMGB1沉默对hTERT相关信号通路的影响

3 讨论

HMGB1过表达与乳腺癌、直肠癌、膀胱癌、鼻咽癌和食管癌密切相关[7-9]。HMGB1在炎症、血管生成、自噬、增殖、凋亡、侵袭和转移等方面发挥着重要作用[10-11]。本研究发现，HMGB1在体外照射后，明显抑制肺癌细胞增殖，提示HMGB1在肺癌生长中起重要作用。DNA损伤需要HMGB1-hTERT的积累，且hTERT受HMGB1释放刺激调控[12]。HMGB1通过不同的信号通路促进肿瘤生长，HMGB1/RAGE的激活与基质金属蛋白酶的表达、肿瘤的增殖和迁移有关[13]。此外，有研究发现，shRNA沉默HMGB1的表达可降低食管癌细胞在照射后的迁移和侵袭能力[14]。

本研究发现，HMGB1通过改变端粒结合蛋白如TPP1(PTOP)、TRF1和TRF2的水平下调端粒稳态，调节肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。有研究表明，HMGB1表达降低与端粒损伤和乳腺癌细胞放射敏感性增加有关，提示HMGB1在调节端粒和细胞对DNA损伤的反应中起着关键作用[15]。另有研究表明，HMGB1表达增加通过启动MCF-7细胞的G1期阻滞和凋亡抑制细胞生长，提示HMGB1在乳腺癌细胞中具有肿瘤抑制和放射增敏的作用[16]。本研究发现，HMGB1下调增强了细胞的放射敏感性，降低了端粒长度和hTERT活性，降低的hTERT活性与较高的放射敏感性相关，并可能导致端粒长度的减少。而有研究表明，HMGB1基因沉默后TERT mRNA和蛋白质表达无明显变化[17]。这些结果之间的差异可能是由于所研究的细胞系不同所致。

细胞周期蛋白D1的主要作用是调节细胞周期从G1期向S期的转变，hTERT和细胞周期蛋白D1的积聚可降低肿瘤细胞的放射敏感性，且细胞周期蛋白D1的表达水平与肿瘤细胞的放射抗性呈正相关[18]。本研究发现，HMGB1基因沉默导致细胞周期蛋白D1表达显著降低，辐射敏感性的增强可能是通过调节细胞周期蛋白D1的表达来实现的。此外，由于细胞周期蛋白D1的减少可以抑制G1/S转变，这解释了H-1299-shHMGB1细胞的增殖受到显著抑制的原因，因为M期是细胞周期中对辐射最敏感的阶段，这也可能提高了这些细胞的辐射敏感性。

综上所述，HMGB1下调破坏人肺癌细胞的端粒稳态，下调hTERT蛋白表达，增强放射敏感性，HMGB1和hTERT可能是肺癌放射治疗疗效预测的潜在靶点。