去卵巢小鼠绝经后骨质疏松模型的建立和综合评定

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院组织胚胎学教研室，广西 百色 533000)

骨质疏松症是一种以骨量低和骨组织结构恶化为特征的疾病，导致骨折风险易感性增加。骨质疏松症的发生率随着年龄的增长而增加，并且由于雌激素缺乏，绝经后妇女中骨质疏松症的发生率最高，因为骨吸收和骨形成之间的平衡朝着骨吸收水平的增加转移[1]。骨质疏松症影响着全世界大约2亿人，其防治仍然是一项艰难的挑战，需要我们去进一步研究和探索新的预防策略和更有效的治疗方式[2]。骨质疏松模型的建立是研究骨质疏松发病机制，合理地选择动物模型对实验的结果起着至关重要的作用，是用药干预治疗防御的基础[3]。卵巢摘除法由于操作简单，造模易成功，实验可重复性高，已成为骨质疏松症常用的动物造模方法，C57BL/6种属的小鼠由于其遗传信息明确，耐受性高，而且消耗的成本比大鼠少，造模周期短，因此选择C57BL/6雌性小鼠作为实验研究的基础媒介[4]。本研究的目的是通过制备去卵巢小鼠骨质疏松模型，建立一种模拟人体病理的骨质疏松症。

1 材料和方法

1.1 实验材料 雌性C57BL/6小鼠，10～12周龄，体重20～25 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司[SCXK(湘)2019-0014]；冰冻切片机Leica CM1950(2019175001，德国)；SAKURA樱花冷冻包埋盒(Surgipath FSC 22 Blue Frozen Section Compound Leica Biosystems Melbourne Pty Ltd-ABN)；Cryofilm type ⅡC(9)SECTION-LAB Co.Ltd.，Japan；TRAP/ALP染色试剂盒(294-67001，FUJIFILM WAKO)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(C0105，碧云天)；荧光倒置显微镜(2015236500，Leica DMI3000B)，Micro CT扫描仪(QuantumGX2，PerkinElmer)。

1.2 实验动物 本研究选取了10只雌性C57BL/6小鼠，10～12周龄，体重20～25 g。所有的动物实验均完全遵守相关伦理审批要求，实验动物饲养流程均严格遵守实验室动物的饲养规程和使用指南。实验前，所有购买的小鼠均于右江民族医学院动物实验中心检疫室饲养7 d适应环境，然后转移至SPF级实验室，每天观察小鼠状态。每个笼子饲养5只，不限水，标准饮食，室温维持在24～26℃，湿度为55%～60%，光照时间适宜，实验过程中小鼠也是继续饲养于SPF级实验室。

1.3 实验分组 10只雌性C57BL/6小鼠随机分组，分别为卵巢摘除骨质疏松模型(OVX)组和假手术(Sham)组，饲养环境和条件均保持一致。术后8周取10只小鼠的左边股骨均进行Micro CT检测，右边股骨用包埋剂包埋，-80℃冰箱保存，由于骨组织较硬，未进行脱钙，因此我们使用SECTION-LAB Co.Ltd切片装置，将其黏附在骨组织包埋块表面，使骨组织转移至该切片装置上，然后使用冰冻切片机进行冰冻切片，厚度为6 μm，行HE染色、TRAP染色、ALP染色、免疫荧光染色。

1.4 卵巢摘除术 将已分组的10只C57BL/6雌性小鼠，75%酒精消毒注射部位后，水合氯醛(4%，5 ml/kg，腹腔注射)进行麻醉，待其行动迟钝后，背部备皮，消毒手术部位，从背部肾区附近双侧分别作一纵行切口，切开筋膜分离肌肉及腹膜，找到附着于脂肪组织上的粉红色卵巢组织，完整摘除两侧卵巢组织，剩下Sham组5只小鼠，则切除卵巢旁小块脂肪组织，手术针线层层缝合，庆大霉素消毒。术后3 d也连续用庆大霉素涂抹伤口，以防手术感染，摘除的卵巢块经冰冻切片(6 μm)，苏木精伊红(HE)染色法镜下鉴定为卵巢组织。

1.5 外周血生物化学学检测 麻醉小鼠后，眼球取血检测血钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)、碱性磷酸酶(ALP)水平等，于右江民族医学院附属医院检验科检验，采用分光光度法检测。

1.6 显微断层扫描技术(Micro CT) 分别取OVX组和Sham组小鼠的股骨标本剔除干净周边软组织，放置于4%多聚甲醛中浸泡24 h后进行Micro CT扫描，电压90 kV；电流80 μA，扫描方式360°旋转，成像视野9 mm×9 mm×9 mm，高分辨率模式分辨率18 μm，扫描时间14 min，扫描完毕后使用系统自带的三维重建软件对所扫描的图片进行重建，得到三维Micro CT数据。

1.7 组织病理学检查 自-80℃低温冰箱取出OVX组和Sham组小鼠股骨头的冰冻切片，将切片置于常温10～15 min回温至37℃，自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，1×PBS缓冲液清洗，依次滴加苏木素1 min，流水冲洗，伊红染液覆盖标本30 s，70%、80%、90%、100%乙醇依次脱水，二甲苯透明，晾干后中性树胶封片，镜下观察。

1.8 组织化学染色 取OVX组和Sham组小鼠股骨头冰冻切片行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)以及碱性磷酸酶染色(ALP染色)。将切片置于常温10～15 min回温37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，流水清洗，滴加适量的按比例配制的TRAP染色液覆盖标本，常温放置30 min(酒石酸溶液∶酸性磷酸酶底物溶液A∶酸性磷酸酶底物溶液B为1∶9∶0.1配置混匀)，PBS清洗，二甲苯透明，中性树胶封片。骨组织切片固定水洗后进行ALP染色，滴加0.1 mol AMPD-HCL缓冲液覆盖组织标本，10 min，滴加适量的碱性磷酸酶预混物溶液，室温保湿盒孵育30 min，然后水洗，核染色试剂覆盖组织5 s，水洗后二甲苯透明，中性树胶封片。

1.9 免疫荧光染色 取OVX组和Sham组小鼠股骨头冰冻切片行免疫荧光染色。切片置于常温10～15 min回温37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min。1xPBS缓冲液清洗2～3次，每次5 min，滴加PBS/1%BSA封闭液，保湿盒常温放置40 min，4℃孵育一抗抗酒石酸酸性磷酸酶(以1∶1000的比例稀释)过夜，DAPI(1 h)染色细胞核，免疫荧光倒置显微镜观察组织。

2 结果

2.1 外周血生物化学检测 行双侧卵巢切除术8周后，经血清学检测，OVX组与Sham组的钙、磷、镁含量变化不大，Sham组的ALP含量比OVX组的含量高(P<0.001)，见表1。

2.2 Micro CT检查 小鼠在卵巢摘除术后8周，股骨经Micro CT扫描三维重建后，与Sham组相比，无论是从横断面还是纵切面来看，OVX组的骨小梁数量减少，排列稀疏，间隔大，分离度也增加，见图1。

表1 双侧卵巢切除术后8周小鼠生化指标变化

注：A：Sham组(纵切面)；B：OVX组(纵切面)；C：Sham组(横切面)；D：OVX组(横切面)。

2.3 组织病理学检查 小鼠术后8周，股骨组织HE染色结果显示，Sham组骨小梁致密、完整、连续；OVX组骨小梁紊乱，出现断裂(见图2A、图2B)。破骨细胞(细胞核>2)计数，单位面积内Sham组的破骨细胞总数比OVX组的少(P<0.01)；在相同的视野下也发现OVX组破骨细胞的数目明显多于Sham组(P<0.01)，差异具有统计学意义，见图2C、图2D，表2。

注：A：Sham组；B：OVX组；C：Sham组；D：OVX组。

表2 术后8周骨组织切片破骨细胞计数

2.4 TRAP染色和ALP染色 小鼠骨组织TRAP染色，TRAP的活性部位呈红紫色；ALP染色，ALP的活性部位呈蓝色(茶褐色)。ALP和TRAP染色显示，与Sham组相比，OVX组ALP酶分泌减少，但差异不明显；而TRAP酶的分泌增多，紫红色区域更深，分布面积更广。

注：TRAP染色，A：Sham组，B：OVX组；ALP染色，C：Sham组，D：OVX组。

2.5 免疫荧光检测结果 荧光倒置显微镜观察发现OVX组的骨组织上TRAP蛋白(绿色荧光)的表达增多，见图4。

注：A～C：Sham组；D～F：OVX组。

3 讨论

随着人口老龄化的增加，绝经后骨质疏松症已成为全球性的公共卫生问题。雌激素和孕激素可以影响骨的生长，雌激素的缺乏引发了骨质流失的快速阶段，增加绝经后骨质疏松妇女患骨质疏松的风险，影响骨代谢的平衡[5]，其水平降低，可显著增加破骨细胞的活性，加速骨吸收，使骨形成不足[6]。在老化的骨骼中，雌激素减少会导致过量的破骨细胞(OC)介导的骨组织吸收，从而导致正常骨代谢失衡，在这一失衡过程中，由单核巨噬细胞分化而来的破骨细胞是唯一具有骨吸收生物学活性的细胞系[7]。因此，破骨细胞在生理和病理性的骨吸收中发挥核心作用，从而导致包括绝经后骨质疏松症的发生。

本研究的实验目的是验证评定双侧卵巢切除后的C57BL/6小鼠是否形成骨质疏松状态，以便考究是否可以进行下一步的药物治疗骨质疏松症的活体实验。由于大鼠的骨代谢周期久，造模时间长，用药多，耗资大，因此我们选择10～12周龄、成熟的、骨代谢水平趋于稳定的C57BL/6雌性小鼠行双侧卵巢摘除法以建立骨质疏松症模型[8]。现今也有很多其他的造模方法，如维甲酸、链脲佐菌素诱导方法等。但是由于卵巢切除法简单易行，成本小，不易感染，造模成功率高，如今成为了FDA和WHO公认的研究绝经后雌激素缺乏型骨质疏松症的最佳模型[9]。骨质疏松模型的鉴定方法也多种多样，从血清学骨代谢生化指标、病理组织形态学分析、骨组织计量方法等均能阐述骨组织的改变情况。传统的骨质疏松模型鉴定方法单一，我们通过综合多种检测方法客观评定骨质疏松模型的成功与否，以便进行下一步的小鼠体内药物干预实验。

既往的研究发现[10]，由于小鼠体积较小，使用双能X线骨密度仪(dual energyX-ray absorptiometry，DEXA)测量小鼠的骨密度存在较大误差，结果的准确性不高；而Micro CT的分辨率可达微米级别，对骨组织的微结构可进行精确的测量，其测量参数的一致性和可重复性更高[8]，更适合用于评估小鼠的骨微结构的改变以及骨质疏松模型，能更早、更真实地反映出老年骨组织结构的改变情况[11]。本研究的结果也发现小鼠股骨远端行Micro CT扫描重建后发现骨小梁的数目以及结构发生明显改变，而骨组织切片HE染色形态学观察也证实了符合骨质疏松的病理改变情况，初步验证了骨质疏松模型建立成功。

TRAP是显示骨吸收以及破骨细胞活性的良好标志物，可以比较直观地反映出机体的骨代谢情况，观察破骨细胞的分化程度；而ALP是反映成骨形成的重要标志物。TRAP染色结果显示TRAP酶的颜色以及分布面积增加，提示OVX组破骨细胞比Sham组的更加活跃；免疫荧光染色的结果也证实了这一结果；而ALP则相反，卵巢摘除后成骨细胞的活性及数目均降低。从血清生化指标检测以及病理组织切片HE、TRAP、ALP染色、免疫荧光结果分析均反映了骨形成活性降低，成骨细胞凋亡，破骨细胞与成骨细胞的动态失衡导致骨细胞功能的丧失，骨组织微结构之间的空隙增加，骨质疏松加剧，进一步证实了上述结果的可信。

骨小梁结构和数目的改变，血清生化检测指标的变化以及病理组织染色反映了骨组织结构发生较大的改变，证实了双侧卵巢摘除法使小鼠发生骨质疏松模型很成功，可以进行后期小鼠体内药物的干预实验，以期为骨质疏松提供合理、有效的治疗策略。