不同极性溶剂的草果提取物抗氧化活性研究

3陆海峰

(1. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院科学实验中心，广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000)

草果[1]【别名】：草果仁、草果子(AmomumtsaokoCrevostetLemarie)为姜科植物的干燥成熟果实，也是豆蔻属多年生草本植物，茎丛生，高可达3米，全株有辛香气，秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干或低温干燥，分布于中国云南、广西、贵州等省区，栽培或野生于疏林下，海拔1100～1800米。草果是药食两用中药材大宗品种之一，草果作调味香料；全株可提取芳香油。果实入药，具有燥湿健脾，除痰截疟的功能。许多中成药的配方都含有草果，如透骨搜风丸、益肾丸、开郁舒肝丸、宽胸利膈丸、洁白丸等。草果味辛，性温；归脾、胃经；芳烈燥散；临床上主治脘腹胀满、反胃呕吐、食积疟疾、胸膈痞满、脘腹冷痛、恶心呕吐、泄泻下痢、食积不消、霍乱、瘟疫、瘴疟等症。抗氧化活性研究已成为评价保健食品、药品开发的重要内容。研究表明[2]，草果具有调节胃肠功能、减肥降脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防霉和抗炎镇痛等药理作用。本文为草果的进一步深入研究开发及应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 粉碎后的草果、95%乙醇、蒸馏水、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇、BHT(2 ，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、ABTS[2 ，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]、K2S2O8、FeSO4·7H2O、水杨酸、H2O2、菲啰嗪、FeCl2：均为国产分析纯。

1.2 仪器 紫外可见分光光度计(N4S型，棱光牌，上海仪电分析仪器有限公司生产)；分析天平(FA1204B型，上海天美天平仪器有限公司生产)；循环水式多用真空泵(SHB-B88型，郑州长城科工贸有限公司生产)；真空干燥箱(DZF-6020型，广州市星烁仪器有限公司生产)；旋转蒸发器(RE-3000A型，上海亚荣生化仪器厂生产)；数显恒温水浴锅(HH-Z4型，金坛市城东光芒仪器厂生产)。

1.3 方法 称取粉碎后的草果5 kg，放入圆底烧瓶中， 加入适量95%乙醇进行加热回流2 h，反复提取3次，合并每次得到滤液，并用纱布进行过滤，过滤好的液体经旋转蒸发仪蒸发浓缩，再经水浴锅蒸发至无乙醇味膏状。取适量的提取物浸膏，用少量蒸馏水溶解后，按照1∶1比例先后顺序放入有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次；最后，得到4个极性部位，对其进行蒸发浓缩干燥，低温下保存。分别精密称量4个极性部位的浸膏0.05 g，并用甲醇定容至50 ml，浓度都为1 g/L，然后分别配制成0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、3.0 μg/ml、4.0 μg/ml，封口放置在低温下冷藏(4℃)备用。

1.4 草果提取物抗氧化活性的测定

1.4.1 ABTS+自由基清除能力的测定 配置ABTS+溶液：称取0.384 g ABTS用蒸馏水溶解后，定容至100 ml，使ABTS溶液浓度为7 mmol/L。称取0.1514 g的过硫酸钾用蒸馏水溶解，定容至10 ml，K2S2O8溶液浓度为2.45 mmol/L。取100 ml ABTS+溶液和4.6 ml K2S2O8溶液混合，室温下避光保存 16 h，使用前用无水乙醇稀释，作为工作液备用。往具塞试管加入6 ml ABTS+溶液和0.6 ml不同浓度提取液，进行均匀混合后，避光反应1 h，测定在波长λ=734 nm处的吸光度A1；同样操作下，测定 6 ml无水乙醇和0.6 ml不同浓度提取液的吸光度A2；同时测定6 ml ABTS+溶液和0.6 ml无水乙醇吸光度A0，把BHT作为阳性对照品，计算ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)]/A0×100%。

1.4.2 羟自由基清除能力的测定 事先配制好需要用的提取物溶液浓度，分次加1 ml 9 mmoL/L FeSO4溶液和1 ml 9 mmoL/L水杨酸-乙醇溶液于试管中，再向具塞量筒加入不同浓度提取物溶液3 ml和8.8 mmoL/L H2O2溶液1 ml，并在温度37℃下反应40 min，用蒸馏水作为空白调零，用BHT做阳性对照品，测其吸光度在510 nm处，按以下公式计算清除率。羟自由基清除率(%)=[1-( A0-A1) /A0]×100%，式中A0：0.5 ml FeSO4溶液+0.5 ml水杨酸-乙醇溶液+蒸馏水定容到10 ml+0.5 ml H2O2溶液；A1：0.5 ml FeSO4溶液+0.5 ml水杨酸-乙醇溶液+3 ml样品溶液+蒸馏水定容到10 ml +0.5 ml H2O2溶液。

1.4.3 金属离子(Fe2+)螯合能力的测定 用分析天平称取0.04 g FeCl2，用蒸馏水溶解，并定容至100 ml，得到2 mmol/L FeCl2溶液，同时称取0.1255 g菲洛嗪，用蒸馏水溶解，并定容至50 ml，得到5 mmol/L菲啰嗪溶液。然后分别用移液枪量取不同浓度样品2 ml加入到有浓度为2 mmol/L FeCl2溶液0.1 ml的具塞试管中，经室温孵育后，加入0.2 ml的5 mmol/L菲洛嗪试剂，最后加入3 ml蒸馏水，反应10 min后，在562 nm处读取吸光值。金属离子(Fe2+)螯合清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100%。A0：2 ml蒸馏水+0.1 ml FeCl2+0.2 ml 5 mmol/L菲啰嗪+3 ml蒸馏水的吸光度值；A1：2 ml样品+0.1 ml FeCl2+0.2 ml 5 mmol/L菲啰嗪+3 ml蒸馏水的吸光度值。

2 结果

2.1 ABTS+自由基清除能力的结果分析 提取物溶液加入ABTS+溶液后，ABTS+会与提取物的抗氧化成分发生反应，生成稳定化合物，使溶液褪色，由此，说明清除率越高抗氧化能力越高。从图1可知，不同极性溶剂的草果提取物对ABTS+自由基清除率中BHT阳性对照品的清除率最强，高达90.56%，说明其抗氧化能力最好。提取物对ABTS+自由基的清除能力大小为BHT>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚。

图1 不同提取物浓度对ABTS+自由基清除率的影响

2.2 羟自由基清除能力的结果分析 羟自由基能力是测定抗氧化活性的常用指标之一，羟自由基的清除率越高说明其抗氧化能力越高。从图2可知，草果提取物对羟自由基表现出了不同的清除能力，正丁醇部位清除率最高，但整体清除率比ABTS+自由基清除率低很多，在相同提取物浓度中，正丁醇部位对羟自由基清除能力最强，其次是BHT，而且不同极性部位之间的清除率较为接近，均在0%～25%范围内，特别是乙酸乙酯和石油醚部位清除率很相近。羟自由基清除能力大小为：正丁醇部位>BHT>石油醚部位>乙酸乙酯部位>水部位。

图2 不同提取物浓度对羟自由基清除率的影响

2.3 金属离子(Fe2+)螯合清除能力的结果分析 从图3可知，草果提取物都具有对Fe2+螯合的清除能力，其浓度越高清除率越强，极性不同清除率也不一样。其中以阳性对照品BHT对其清除能力影响较大，对金属离子(Fe2+)螯合清除率从8%大幅度的增加到30%。在提取物浓度为4 μg/ml时，BHT清除率接近最高点30%。而其他极性部位清除率均稳定上升，但不同极性部位的草果提取物清除能力相差不大，上升幅度在10%之间。金属离子(Fe2+)螯合清除能力大小为：正丁醇部位>BHT>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位。

图3 不同提取物浓度对Fe2+螯合清除率的影响

3 讨论

草果含有抗氧化成分，具有抗氧化活性，但抗氧化活性能力并不一样。实验图表的曲线均呈现上升趋势，并且清除能力随浓度增加而不断增强。三个数据图表结果表明，在BHT部位清除能力最好，有很好的抗氧化活性，其次是正丁醇部位体现了强的稳定的抗氧化活性能力。因此，为研究草果在抗氧化活性方面奠定了坚实的基础。

本论文使用有机溶剂醇提取法，并对草果进行体外抗氧化活性的测定，测定草果提取物对ABTS+自由基、羟自由基的清除能力以及金属离子(Fe2+)螯合清除能力，发现草果对ABTS+自由基清除能力最强，抗氧化活性最好，以BHT清除能力最好，高达90%；正丁醇部位对清除羟自由基的清除能力效果较好；螯合Fe2+的能力在提取物浓度为4μg/ml时BHT最强，草果在一定浓度范围内随提取物浓度的增加而增强。综上所述，表明了不同极性溶剂的草果提取物具有良好的抗氧化活性和抗自由基清除能力。