miR-20a过表达促进VEGF表达及血管平滑肌细胞活性和迁移

王桂娟

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种常见的破坏性和危及生命的疾病，其特征在于大动脉中纤维元素和脂质的积累［1］。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）是构成动脉血管壁的主要细胞成分，调控增殖、迁移和凋亡等异常细胞功能促进AS 的形成和发展［2］。然而，VSMC 对AS 影响的详细分子机制仍不清楚。研究表明，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通过调控血管生成影响AS斑块的形成和发展［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度为18～24 个核苷酸的非编码RNA分子，通过与靶基因的3'非翻译区（3'untranslated regions，3'UTR）结合来抑制翻译或诱导mRNA 切割。最近，许多研究表明miRNA 通过调控VSMC的增殖、迁移、表型转换和体内血管重塑等参与AS 的进展［4］。miR-20a 属于miR-17-92 簇，在多种恶性肿瘤中发挥作用，包括结肠癌、前列腺癌、胃癌和肺癌等［5］。然而，迄今为止，miR-20a 在VSMC中的生物学功能尚未明确阐明。本研究探究miR-20a 对VSMC 活性和迁移及VEGF 表达的影响以及可能的机制，以期为AS 的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂

人主动脉血管平滑肌细胞系T/G HAVSMC（美国ATCC）；SmGM-2 培养基（瑞士龙沙集团有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（赛默飞世尔科技公司）；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；除抗体外Western blot 检测所需试剂（上海碧云天生物技术研究所）；miR-20a mimics 及mimics NC（上海吉玛制药有限公司）；脂质体2000转染试剂（美国Invitrogen 公司）；Real-time PCR Kit检测试剂盒（上海研卉生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；Transwell 下室（美国BD 公司）；VEGF、CNN1 抗体（美国NEB 公司）；辣根过氧化酶标记的二抗（美国CST 公司）；荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega 公司）。

1.2 细胞培养

人血管平滑肌细胞培养在含5%灭活胎牛血清的SmGM-2 培养液中，置于体积分数5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，细胞生长融合度达90%以上时以胰蛋白酶消化传代，指数生长期的细胞用于后续实验。……