南瓜籽油中角鲨烯含量及特征指标比较

杨学芳，张继光，吴万富，吕世懂*

1(昆明医科大学 科技成果孵化中心，云南 昆明,650500)2(昆明市粮油饲料产品质量检验中心，云南 昆明,650118)3(云南省粮油产品质量监督检验站，云南 昆明,650118)4(云南昆明国家粮食质量监测站，云南 昆明,650118)

南瓜籽是葫芦科南瓜属植物南瓜(CucurbitamoschataDuch.)的种子[1]。南瓜籽中含有丰富的油脂，通过溶剂萃取、物理压榨和超临界CO2萃取等各种方式均可以制备南瓜籽油，目前主要通过低温冷榨法制取，因为这样能最大程度保留油脂中的南瓜香味及营养物质[2-3]。南瓜籽油中维生素E、甾醇、微量元素和角鲨烯等含量较高，同时，不饱和脂肪酸含量高达70%以上，主要为亚油酸和油酸[4-6]。南瓜籽油对心脑血管疾病具有预防和保健作用，且对前列腺增生具有良好的治疗和预防作用[7-9]，因此开发利用价值较大。

油脂的特征指标，主要包括脂肪酸组成、折光指数、密度、碘值和皂化值等，是判断油脂真实性的重要参考依据。特别是脂肪酸组成，是衡量食用油营养价值的重要指标，不同种类的油脂都有其特征脂肪酸,以及相对稳定的脂肪酸组成比例[10]。角鲨烯是一种对人体有益的不饱和烃类化合物，由于其良好的生物活性及在食品和化妆品等领域的广泛应用，最近几年相关研究较多，角鲨烯在一些植物油中的含量较高，比如南瓜籽油和橄榄油[11-13]。

对南瓜籽油的相关成分进行研究，可进一步挖掘南瓜籽的开发利用价值。目前已经有一些文献对南瓜籽油中的特征指标和角鲨烯含量进行了研究[14-16]，但研究的样本数量相对较少，产地的覆盖范围有限，缺乏系统研究，特别是南瓜籽油中角鲨烯含量与其他油脂间的比较研究还较少。本文拟通过收集我国不同产地的南瓜籽油，对其特征指标和角鲨烯含量进行比较，并通过主成分分析法(principal component analysis,PCA)来初步探索南瓜籽油的相似及差异性，为科学评价南瓜籽油的营养成分和综合开发利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

10种南瓜籽油(编号为N1-N10)，市售，详细信息见表1。

1.1.2 标准品和试剂

37种脂肪酸甲酯混合标准品(C4-C24),美国西格玛公司；角鲨烯标准品,坛墨质检科技股份有限公司，纯度为99.6%。KI、异辛烷、淀粉、Na2S2O3、环己烷、KOH、酚酞、ICl、甲醇、冰乙酸、石油醚(沸程30～60 ℃)，均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；95%乙醇、盐酸、Na2SO4,均为分析纯，西陇化工

股份有限公司；NaHSO4,分析纯，天津市光复精细化工研究所；正己烷、异辛烷,均为色谱纯，德国默克(Merck)公司；实验过程中用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

分析天平(分度值0.000 1 g)和移液器(0.1～1 mL),瑞士梅特勒-托利多公司；GC 1310气相色谱仪[配氢火焰离子化检测器及变色龙数据处理系统(Chromeleon 7.2)]、Trace GC1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪(配Xcalibur数据处理系统)，美国赛默飞世尔科技公司；Abbemat 3200数字式自动折光指数测定仪、DMA 500密度计,奥地利安东帕公司；Milli-Q超纯水机,美国密理博公司；TDL-40B高速离心机,上海安亭科学仪器厂；SBL-15DT超声波恒温清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司；LPD2500多管旋涡混合仪、NG150-1B氮吹仪,莱普特科学仪器(北京)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 碘值、皂化值的测定

碘值的测定参照GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》[17]；皂化值的测定参照GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》[18]。

1.3.2 折光指数的测定

采用自动数字式折光仪进行测定。开机，待仪器稳定达到测量条件后，滴加2～3滴待测油样于棱镜中央，盖上样品槽盖，待温度稳定后，点击测试，记录数据，样品测试完毕用石油醚清洗干净后接着测试下一个样品。

1.3.3 相对密度的测定

采用数字式密度计进行测定。开机，待仪器稳定达到测量条件后，用水进行校准，用注射器吸取一定量的样品润洗3次后，注入一定量的样品(确保无气泡)，仪器自动显示被测对象的相对密度，测定完成后，用下一个待测油样清洗系统后再测，测定完成后，用石油醚把系统清洗干净再关机。

1.3.4 脂肪酸组成的测定

采用气相色谱法，参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[19]第三法，采用面积归一化法定量，用100 m的毛细管柱进行分离，确保37种脂肪酸甲酯均能实现良好分离，具体的前处理过程、气相色谱条件以及计算过程同文献[20]。

1.3.5 角鲨烯含量的测定

实验室采用GC-MS测定南瓜籽油中角鲨烯的含量，采用外标法进行定量研究。前处理的操作步骤和仪器条件参考文献[21]。同时从线性范围、仪器精密度和加标回收率等方面对所使用的方法进行了验证，验证结果能满足分析要求。具体的前处理过程为：称取0.5 g南瓜籽油样品(精确至0.000 1 g)于15 mL离心管中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液4 mL，75 ℃超声波皂化40 min，取出离心管，冷却至室温，加入4 mL一级水、3 mL正己烷，涡旋振荡提取5 min，4 000 r/min离心5 min，转移上层(正己烷层)至10 mL刻度离心管中，然后再用正己烷提取2次，每次3 mL，均取上层(正己烷层)至10 mL刻度离心管中，然后在50 ℃氮吹仪上吹干，用10 mL正己烷定容，取部分定容液4 000 r/min离心5 min，过0.22 μm有机滤膜后上机。如果试样测出的浓度超过标准曲线的线性范围，则需要进一步稀释后再测。

1.3.5.1 角鲨烯标准溶液的配制

准确称取0.010 0 g角鲨烯标准品至烧杯中，加入少许正己烷溶解，移入10 mL棕色容量瓶后，用正己烷定容，充分混匀，得到质量浓度为1 mg/mL的储备液，避光冷藏备用。然后再用移液器准确移取1 mL上述储备液于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，充分混匀，得到质量浓度为100 μg/mL的中间液。利用该中间液，用正己烷逐级稀释成质量浓度为0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 μg/mL的标准工作溶液。

1.3.5.2 GC-MS条件

GC条件：赛默飞TG-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温箱：初始温度200 ℃， 保持1 min；20 ℃/min 升到310 ℃保持5 min；载气为高纯He(纯度99.999%)；流速 1.0 mL/min；SSL进样口，温度300 ℃，分流进样，分流流量10 mL/min，分流比为10∶1。MS条件：质谱传输线温度300 ℃，离子化模式EI，温度280 ℃，扫描模式SIM，其中定量离子的荷质比69，定性离子的荷质比81、95和137，溶剂延迟时间5 min。

1.4 结果计算与数据处理

所有指标的测定均重复2次，结果以平均值表示。其中碘值、皂化值和脂肪酸组成的结果计算同GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》[17]、GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》[18]、GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[19]；密度和折光指数的数值由仪器直接显示，取值保留到小数点后4位；碘值、皂化值保留到小数点后1位；脂肪酸组成和角鲨烯的结果保留3位有效数字。PCA采用多元统计学分析软件SIMCA-P15。

2 结果与分析

2.1 南瓜籽油特征成分分析

分别对10个南瓜籽油样品的特征指标进行测定分析，其中37种脂肪酸甲酯混合标准品的色谱图如图1所示，南瓜籽油样品(编号为N1)的色谱图如图2所示，特征指标测定结果见表2。

从图1可知，37种脂肪酸甲酯混标能得到较好分离，为了保证检测结果的准确性，在试验过程中加了有证书的质控样，检测结果均满意。由表2可知，南瓜籽油的相对密度为0.918 8～0.921 5；折光指数为1.456 0～1.466 9；碘值为108.4～116.2 g/100 g；皂化值为188.9～192.4 mg/g；10个南瓜籽油中共检出14种脂肪酸，主要为亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸，以不饱和脂肪酸为主，含量为78.2%～82.0%。通过色泽判断部分南瓜籽油的加工工艺不相同，但特征指标组成及含量均很接近，说明加工工艺对油脂特征指标的影响不大。柴杰等[22]对葵花籽油整个精炼过程中的品质变化进行了分析，发现整个精炼过程脂肪酸组成及含量变化较小，与本文结果一致。另外，有研究发现,南瓜籽油中不饱和脂肪酸的含量和橄榄油、葵花籽油、油茶籽油等中的含量接近，都在80%左右[16,23-25]。从营养平衡的角度考虑，油脂中具有较高含量的油酸和亚油酸，对人体健康具有重要意义。从测定结果可以看出，南瓜籽油具有较高含量的油酸和亚油酸，因此，营养价值较高，开发前景很大。

图1 37种脂肪酸甲酯混标色谱图Fig.1 Gas chromatograms of 37 mixed fatty acid methyl ester standards

图2 南瓜籽油样品(N1)的脂肪酸甲酯的气相色谱图Fig.2 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the pumpkin seed oil sample (No.N1)

表2 十个南瓜籽油特征指标检测结果Table 2 Test results of characteristic indexes in 10 pumpkin seed oil samples

2.2 南瓜籽油中角鲨烯含量的比较分析

2.2.1 南瓜籽油中角鲨烯含量的测定

按照1.3.5的方法和条件，分别对10个南瓜籽油样品的角鲨烯含量进行分析，其中角鲨烯标准品的GC-MS-SIM图如图3所示，南瓜籽油样品(N1)的角鲨烯的GC-MS-SIM图见图4,10个南瓜籽油样品角鲨烯含量测定结果见表3。

图3 SIM扫描模式下角鲨烯标准品的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of squalene standard in SIM scan mode

图4 SIM扫描模式下南瓜籽油样品(N1)的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of pumpkin seed oil sample in SIM scan mode (No.N1)

表3 十个南瓜籽油样品中角鲨烯含量检测结果Table 3 Test results of squalene in 10 pumpkin seed oil samples

从表3可知，10个南瓜籽油含鲨烯含量范围较大，最低的为N8，310 mg/kg；最高的为N4，检测结果为4 446 mg/kg。可能与制油的工艺有关，此结果也说明了南瓜籽中含有较高含量的角鲨烯。本实验所用的10个南瓜籽油样品均用物理压榨的方式来制油，但是从油脂的色泽(图5)可以看出，尽管都是采用物理压榨方式，但有些南瓜籽油是经过粗加工后(比如用低温冷榨机榨取后过滤)制取的，而有的可能是在粗加工的基础上，经过加酸、加减、脱色、脱臭等处理后精炼而成的。在颜色较深的南瓜籽油中，角鲨烯含量比颜色浅的南瓜籽油高，即N3、N4、N5、N6和N9中含量均高于其他南瓜籽油，其中N4和N6号样品标签上标示的就是低温压榨；而N1和N8号样品可能就是因为工艺的原因而导致角鲨烯的部分损失，其含量明显低于其他南瓜籽油。柴杰等[22]的研究也表明，精炼过程中会导致葵花籽油角鲨烯含量大幅降低。南瓜籽油中角鲨烯含量较高，具有较大的开发研究价值，至于含量差异较大的原因，可能是不同的制油工艺所致。

图5 南瓜籽油样品的色泽图Fig.5 Color of pumpkin seed oil samples

相关文献报道[11-12,26-27]，橄榄油的角鲨烯含量较高(>1 000 mg/kg)，为了进一步和其他油脂进行比较，实验选取了一些特种木本油脂做对比，分别是茶叶籽油、橄榄油、美藤果油、橡胶籽油、铁核桃油、澳洲坚果油和牛油果油，每种选取3个样品，测定了这些油脂中的角鲨烯含量。结果表明，核桃油中角鲨烯含量为28.6～34.0 mg/kg；澳洲坚果油中含量为80.6～304 mg/kg；茶叶籽油中含量为125～251 mg/kg；橄榄油中含量为1 232～7 176 mg/kg；牛油果油中含量为190～258 mg/kg；而美藤果油和橡胶籽油中角鲨烯含量均小于10 mg/kg。可以看出，南瓜籽油中的角鲨烯含量是唯一能和橄榄油相媲美的。

2.2.2 角鲨烯的线性范围、加标回收率和精密性考察

目前，角鲨烯测定采用LS/T 6120—2017《粮油检验 植物油中角鲨烯的测定 气相色谱法》[28]，但该方法前处理较为繁琐，不适合大批量样品的处理，所以本实验参考吕春玲等[21]的方法。

为尽可能覆盖不同样品的角鲨烯含量范围，设定的线性范围较宽，0.50～40.0 μg/mL，对应覆盖的检测范围为10～800 mg/kg，相关系数R2为0.998 0；峰面积的RSD值为1.79%，精密度符合要求。同时，本实验做了2个梯度水平的加标回收率，10 mg/kg的加标回收率为79.2%，100 mg/kg的加标回收率为101.0%，回收率也满足分析要求。

2.3 主成分分析

为进一步探索这些南瓜籽油的聚类情况，把10个样品的特征指标和角鲨烯含量进行主成分分析。PCA是基于降维的思想，把多指标转化为少数几个综合指标，通过平面坐标可在总体上对样品进行一致性的分析，而一般的统计技术只能对某一指标进行评价[29-31]。主成分分析的样品得分图见图6。

图6 基于特征指标和角鲨烯含量的10个南瓜籽油的主成分得分图Fig.6 PCA score scatter plot based on the content of squalene and characteristic indexes in the 10 pumpkin seed oil samples

前2个主成分中，解释方差的累积值R2X为0.714，当前变量的预测能力Q2为0.235，对应主成分 1和2 的解释率：R2X[1]和R2X[2] 分别为0.441和0.273，Hotelling’s T2(95%)时，所有样品均在灰色圆圈(Ellipse)内，说明没有异常值。从图6可以看出，10个南瓜籽油分成了几个区域，其中N8号样品和其他样品离得很远，这可能和其角鲨烯含量较其它样品低有关。N1、N2、N10、N7聚合很近，N3、N9、N6、N4、N5则聚在左边，这种聚合和油脂所显的色泽也基本吻合，说明最主要的原因可能还是由于油脂加工工艺的不同，导致了它们在一些成分上的差异(尤其是角鲨烯含量)，从而在主成分得分图上形成了各自的聚类与区分。

3 结论

本文对我国不同产地的南瓜籽油的特征成分和角鲨烯含量进行了分析，以期为南瓜籽的综合开发利用提供理论支撑。结果表明，南瓜籽油的相对密度为0.918 8～0.921 5；折光指数为1.456 0～1.466 9；碘值为108.4～116.2 g/100 g；皂化值为188.9～192.4 mg/g；脂肪酸组成中，以亚油酸和油酸为主，不饱和脂肪酸含量为78.2%～82.0%；南瓜籽中角鲨烯含量较高，和橄榄油相当，显著高于茶叶籽油、核桃油、澳洲坚果油和牛油果油等特种木本油脂，但本次实验所选的南瓜籽油角鲨烯含量范围较大，最低为310 mg/kg，最高为4 446 mg/kg，结合PCA、油脂色泽和角鲨烯含量综合判断，可能和油脂的制取工艺有关。总之，南瓜籽油是一种营养成分较好，极具开发价值和推广的特种木本油脂。