七叶皂苷钠通过调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制神经元细胞凋亡改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤

李侑埕，陈立刚，孔睿，梁国标

（1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地神经外科，辽宁沈阳 121001；2.北部战区总医院神经外科，辽宁沈阳 110016）

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）具有相当高的死亡率和发病率[1-2]。因此，预防和减轻蛛网膜下腔出血后的脑损伤具有重要的意义。目前，早期脑损伤（early brain injury，EBI）被指出可能是蛛网膜下腔出血患者的主要死亡原因[3]，成为新的研究热点。天师栗，是七叶树科植物天师栗Aesculus wilsoniiRehd.及七叶树A.chinensisBge.的果实或种子，通称娑罗子，具有宽中、下气、杀虫的功效，用于治疗胃寒疼痛，脘腹胀满，疳积虫痛，痢疾，疟疾。七叶皂苷钠是天师栗成熟种子的三萜皂苷的钠盐提取物。研究表明，七叶皂苷钠具有抗炎、消肿、抗渗出，改善微循环、增强血管张力收缩性，抗氧化、清除自由基，抗肿瘤，神经保护等作用，对软组织损伤、心脑血管疾病和渗出性疾病具有治疗价值[4]。已有大量临床和实验研究表明，七叶皂苷钠对脑损伤有修复作用[5]。基于此，本研究探讨七叶皂苷钠是否对蛛网膜下腔出血后的早期神经损伤发挥保护作用，以期为七叶皂苷钠临床治疗蛛网膜下腔出血提供依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性C57BL/6J小鼠，体质量18～22 g，清洁级，购自北部战区总医院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2014-0002。小鼠分笼饲养，每笼5～8只，饲养室温为23～25℃，相对湿度40%～80%，自由饮水进食。本研究获北部战区总医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物、试剂与仪器七叶皂苷钠购自山东绿叶制药有限公司（批号：H20003239），分子量1 124.2。七叶皂苷钠用生理盐水使之充分溶解，工作液浓度为2.8 mg/kg，现用现配[6]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）、血红素氧合酶1（HO-1）等抗体（美国Abcam公司）；核因子E2相关因子2（Nrf2）、β-actin（美国Santa Cruz公司）；伊文思蓝（美国Sigma-Aldrich公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、原位末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记（TUNEL）染色试剂盒、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、电化学发光（ECL）试剂盒（碧云天公司）；神经元核抗原（NeuN）抗体（美国Abcam公司）；Alexa Fluor 594荧光抗体（美国Sigma公司）。ar-2130型分析天平（美国安泰克公司）；dhg-9240a型鼓风干燥箱（上海精密科学仪器公司）；rad3cell型微量蛋白电泳仪（美国北京伯乐分析生化仪器公司）。

1.3 分组、造模与给药将小鼠随机分为3组，包括假手术组（32只）、模型组（48只）、七叶皂苷钠组（38只）。参考文献[3，7]采用颈内动脉穿刺法建立小鼠蛛网膜下腔出血模型。方法：将小鼠用10 g/L戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，显露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉；经颈外动脉向颈内动脉插入4-0尼龙线，进一步插入颅内颈内动脉，直到感觉到阻力，然后再推入5 mm，以穿透颈内动脉壁。假手术组接受除不刺穿颈内动脉外相同的手术。造模结束1 h后，七叶皂苷钠组小鼠给予一次性腹腔注射七叶皂苷钠2.8 mg/kg，假手术组和模型组小鼠给予一次性腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 神经功能评分 于蛛网膜下腔出血后24 h行盲法评定神经学评分，包括改良的Garcia评分和平衡木测试[8]。改良的Garcia评分细则见表1。平衡木测试：将90 cm长、1 cm宽的圆柱形横木放在2个平板中间，实验前将大鼠在两侧平板上分别放置10 s，然后把大鼠放在横木中间，观察其移动。根据步行距离进行评分：40 s内没有移动，且直接从横木上跌落，计0分；40 s内没有跌落，也没有移动，计1分；40 s内移动了22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在该位置至少25 s，计2分；40 s内移动了超过22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在该位置至少25 s，计3分；40 s内到达平板或者25 s内走完一半的距离没爬上平板，计4分；25 s内到达平板，计5分。计算连续次试验的平均得分。分数越高，表示神经功能越好。

1.4.2 蛛网膜下腔出血分级 深度麻醉小鼠后取脑组织，进行蛛网膜下腔出血评分[9]。将Willis动脉环和基底动脉环分为6段，根据蛛网膜下腔血凝块的多少，各节段评分0～3分。蛛网膜下腔出血分级分为3组：轻度，0～7分；中度，8～12分；重度：13～18分。

1.4.3 脑含水量 于蛛网膜下腔出血后24 h深麻醉小鼠取脑。取出后立即称湿质量，在10℃烘箱中烘干72 h后称干质量，计算脑含水量。公式[10]：脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.4.4 伊文思蓝渗出法检测血脑屏障完整性 于蛛网膜下腔出血后24 h，经尾静脉注射伊文思蓝染料（20 g/L；5 mL/kg）。60 min后深度麻醉小鼠，经心内灌注磷酸盐缓冲液（PBS）去除血管内伊文思蓝。取出大脑，称量脑组织加入PBS匀浆，以5 000×g离心40 min。将上清液与等体积的含有三氯乙酸和乙醇（1∶3）的溶液混合，4℃孵育过夜，以15 000×g离心30 min，取上清液。用荧光分光光度计测定上清液中伊文思蓝的浓度。

1.4.5 TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫荧光染色法观察神经元细胞凋亡 将脑组织切片用蛋白酶37℃消化15 min，PBS水洗，滴加TDT+DIGUTP混合液，37℃孵育2 h，PBS水洗；滴加封闭液置室温孵育30 min，滴加抗地高辛抗体+NeuN抗体混合液4℃孵育过夜。PBS洗后滴加荧光二抗37℃孵育30 min。最后以DAPI复染细胞核，显微镜下观察。计数TUNEL和NeuN阳性细胞数。

1.4.6 蛋白免疫印迹法检测脑组织Keap1、Nrf2、HO-1表达 于蛛网膜下腔出血后24 h取小鼠左侧大脑半球，加入RIPA裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上，分别与Keap1、Nrf2、HO-1、β-actin等一抗共同置于4℃孵育过夜，再以二抗室温处理1 h。用ECL试剂盒将电泳条带可视化，用ImageJ软件分析电泳条带的灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白的灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计方法采用Graph Pad Prism 5软件和SPSS 16.0统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对蛛网膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神经功能的影响图1-A结果显示，假手术组小鼠死亡率为0%（0/32），模型组小鼠死亡率为33.33%（16/48），七叶皂苷钠组为15.79%（6/38），表明七叶皂苷钠干预后明显降低了蛛网膜下腔出血小鼠的死亡率。图1-B结果显示，模型组小鼠蛛网膜下腔出血评分较假手术组显著增加（P＜0.05），七叶皂苷钠组小鼠蛛网膜下腔出血评分较模型组显著降低（P＜0.05），表明七叶皂苷钠可减少蛛网膜下腔出血小鼠的出血量。对蛛网膜下腔出血后24 h小鼠神经功能进行评估，结果如图1-C、D所示，模型组Garcia评分和平衡木测试评分较假手术组显著降低，而七叶皂苷钠组Garcia评分和平衡木测试评分较模型组升高（P＜0.05），提示七叶皂苷钠能够促进蛛网膜下腔出血小鼠神经功能的恢复。

图1 七叶皂苷钠对蛛网膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神经功能的影响Figure 1 Effects of sodium aescinate on mortality，subarachnoid hemorrhage and nerve function in mice with subarachnoid hemorrhage

2.2 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障的影响图2-A结果显示，模型组小鼠蛛网膜下腔出血后24 h脑含水量较假手术组显著增加，七叶皂苷钠组脑含水量较模型组显著减少。表明七叶皂苷钠给药后可显著减少小鼠蛛网膜下腔出血引起的脑水肿。图2-B结果显示：与假手术组比较，模型组小鼠脑组织伊文思蓝渗出量增加（P＜0.05）；与模型组比较，七叶皂苷钠组脑组织伊文思蓝渗出量减少（P＜0.05）。表明小鼠蛛网膜下腔出血后24 h全脑血脑屏障完整性被破坏，七叶皂苷钠可减轻脑水肿，对全脑血脑屏障有保护作用。

图2 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障的影响Figure 2 Effects of sodium aescinate on blood-brain barrier in mice with subarachnoid hemorrhage

2.3 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后神经元凋亡的影响采用TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫荧光染色法观察七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后神经元凋亡的影响，“NeuN”标志神经元细胞，“TUNEL”染色显示凋亡细胞，“Merge”表示神经元细胞凋亡，如图3所示。图4结果表明，模型组蛛网膜下腔出血小鼠神经元凋亡阳性细胞数目增加，而七叶皂苷钠干预后神经元凋亡阳性细胞数目减少，表明七叶皂苷钠能够抑制小鼠蛛网膜下腔出血后神经元细胞的凋亡，具有保护神经的作用。

图3 各组小鼠脑组织TUNEL/NeuN/DAPI三色荧光染色图像比较Figure 3 Comparison of TUNEL/NeuN/DAPI immunofluorescence staining images in various groups of mice

图4 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后神经元凋亡的影响Figure 4 Effects of sodium aescinate on the apoptosis of nerve cells in mice of subarachnoid hemorrhage

2.4 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后脑组织Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响图5结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织Keap1蛋白表达水平降低，而Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高（均P＜0.05）。与模型组比较，七叶皂苷钠小鼠脑组织Keap1蛋白表达水平升高，而Nrf2、HO-1表达水平降低（均P＜0.05）。表明七叶皂苷钠可能通过调节小鼠脑组织Keap1/Nrf2/HO-1信号通路蛋白减轻蛛网膜下腔出血。

图5 七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后脑组织Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响Figure 5 Effects of sodium aescinate on Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway in mice with subarachnoid hemorrhage

3 讨论

早期脑损伤通常发生在蛛网膜下腔出血后72 h内，在决定蛛网膜下腔出血患者预后中发挥关键作用[11-12]。与血管痉挛损伤机制不同，早期脑损伤可在蛛网膜下腔出血后立即对脑组织造成损伤[13]。早期脑损伤的可能机制包括颅内压（intracranial pressure，ICP）升高，脑血流量（cerebral blood flow，CBF）降低，脑灌注压（cerebral perfusion pressure，CPP）降低，脑氧合下降，血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）破坏，脑水肿和神经细胞死亡等[14]。本研究结果表明，七叶皂苷钠给药能够显著改善蛛网膜下腔出血小鼠血脑屏障损伤及神经功能缺损，减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤。

NeuN蛋白能够特异性结合神经核[15]，且广泛存在于脊椎动物神经系统各个部位的成熟神经细胞核内，更重要的是它在这些物种体内高度保守且在神经细胞生长的特殊阶段稳定表达[16]，故常直接被用作神经细胞的特异性标记物，同时也是直接评价神经细胞丢失、死亡以及量化治疗效应的可信标记物[17]。NeuN蛋白表达的高低可明确反映神经细胞数量的变化。本研究结果表明七叶皂苷钠能够减轻小鼠蛛网膜下腔出血早期脑损伤神经元细胞的凋亡，提示七叶皂苷钠对小鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤可能具有修复作用。

Keap1-Nrf2/ARE通路是近年新发现的机体抵抗外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路[18]。越来越多的证据表明，Nrf2调控的基因产物在中枢神经系统疾病中具有保护作用。在非应激条件下，Nrf2失活，并被Keap1（Nrf2的抑制蛋白）隔离在细胞质中[19]；然而，当暴露于各种刺激时，复合物被分离，游离的Nrf2随后移位到细胞核并与抗氧化相关元件（ARE）结合，导致各种抗氧化和解毒基因的表达，如HO-1[17-18]。HO-1被认为是细胞氧化应激过程中一个非常敏感的指标[20]。HO-1与其催化血红素降解生成的产物胆红素和CO一道，组成了机体重要的内源性保护系统，广泛参与抗炎与多种急慢性氧化应激损伤。多种生长因子、氧化刺激因素、抗氧化药物等能上调HO-1的表达[21]。而HO-1催化血红素的降解产物CO、胆红素和铁蛋白可发挥细胞保护作用[22]。本研究结果表明，七叶皂苷钠可明显上调蛛网膜下腔出血小鼠脑组织Keap1蛋白表达，下调Nrf2、HO-1的表达，提示七叶皂苷钠可能通过调节小鼠脑组织Keap1/Nrf2/HO-1信号通路减轻蛛网膜下腔出血。

综上所述，七叶皂苷钠可以有效改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤，其机制可能与调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路从而抑制神经元细胞凋亡有关。提示七叶皂苷钠可能是一种治疗蛛网膜下腔出血早期脑损伤的潜在药物。