重楼皂苷Ⅶ对裸鼠胰腺癌的治疗作用及机制研究

夏天，韩海霞，冯伟，方丽君，付霞

（1.应城市人民医院急诊科，湖北应城 432400；2.武汉市第六医院江汉大学附属医院急诊科，湖北武汉 430015）

胰腺癌，是最常见的恶性肿瘤之一，由于缺乏早期诊断和治疗方案，其发病率大致接近死亡率[1]。近年来胰腺癌的发病率逐渐增加，主要是由于肥胖、吸烟、酗酒、既往慢性胰腺炎和既往腹部放疗的增加所致[2]。因胰腺癌具有高侵袭和转移性，大约80%的胰腺癌患者被诊断为不可切除的形式[3]。胰腺癌转移常常发生于肿瘤的早期阶段，即使是表面上肿瘤可切除的胰腺癌患者，也往往不能通过手术治愈，因为在手术之前，显微镜下便可观察到癌症已经全身扩散[4]。目前，对不能手术治疗的患者仍然局限于化疗、放疗或两者兼用[5]。因此，迫切需要更全面、有效的治疗策略。重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎；味苦，性寒，有小毒；入心、肝经；具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，用于疔肿痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等病症。重楼皂苷Ⅶ是提取自中药重楼的一种甾体皂苷，可抑制癌细胞增殖、癌细胞周期停滞和调节癌细胞耐药性，已被证明具有很强的抗癌活性，涉及肝癌HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞和结直肠癌HT-29细胞等[6-9]。为进一步观察重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌的抗癌作用，本研究探讨了重楼皂苷Ⅶ对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响及其机制，以期为其临床治疗胰腺癌提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物50只4～6周龄雄性Balb/c裸鼠，体质量为（16±2）g，无特定病原体（specific-pathogen free，SPF）级别，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0008，于河南省实验动物中心SPF级别动物饲养房饲养，实验单位使用许可证编号：SYXK（豫）2016-0002。

1.2 药物、试剂与仪器重楼皂苷Ⅶ（批号：111593-201604；化学式：C51H82O21；分子量：1031.18；纯度≥94.0%）购自中国食品药品检定研究院；5-氟尿嘧啶（批号：B25419）购自上海源叶生物科技有限公司。末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白、GAPDH等抗体购自英国Abcam公司。游标卡尺购自南京智睿生物科技有限公司；Ti2荧光显微镜购自日本尼康株式会社。

1.3 动物模型建立[10]、分组与给药将人胰腺癌细胞系AsPC-1[购自美国模式培养物保藏所（ATCC）]皮下注射裸鼠，构建异种移植瘤模型。2周后待肿瘤体积长到约100 mm3时，将裸鼠随机分为5组，即对照组，重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶组，每组各10只。对照组：每日灌胃0.3 mL生理盐水，持续30 d；重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组：每日分别灌胃重楼皂苷Ⅶ混悬液（对应剂量为5、10、20 mg/kg）0.3 mL，持续30 d；5-氟尿嘧啶组：每日灌胃5-氟尿嘧啶混悬液（剂量为17 mg/kg）0.3 mL，持续30 d。

1.4 测量移植瘤体积与质量30 d后处死裸鼠，切取移植瘤，称取移植瘤质量，用游标卡尺测量移植瘤长径a（mm）和短径b（mm），移植瘤体积=a×b2/2。

1.5 TUNEL法测定移植瘤组织细胞凋亡情况将移植瘤组织用体积分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，厚度为4μm。将石蜡切片脱蜡处理，滴加20μg/mL蛋白酶K，20～37℃作用20 min。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入50μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。用PBS洗涤1次，滴加0.2 mL标记反应终止液，室温孵育10 min。用PBS洗涤3次，继续在样品上加50μL Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min。用PBS洗涤3次，最后滴加0.3 mL 3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色液后在荧光显微镜下观测。

1.6 蛋白免疫印迹法检测胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平取裸鼠移植瘤组织，以4℃预冷的PBS清洗3次，加入裂解液提取总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定蛋白含量。取适量样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用体积分数5%牛血清白蛋白（BSA）4℃封闭4 h，加入一抗（分别为Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体）孵育过夜，清洗后再加入二抗孵育1 h，最后加入发光液曝光、显影。用ImageJ软件分析灰度值计算目的蛋白的相对表达量，以GAPDH为内参。

1.7 统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，所有计量数据以均数±标准差（±s）表示。首先分析正态分布和方差齐性，符合条件的数据采用单因素方差分析或t检验，不符合条件的数据则采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重楼皂苷Ⅶ降低胰腺癌裸鼠移植瘤体积图1结果显示：重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌裸鼠移植瘤体积均显著低于对照组（P＜0.01），且重楼皂苷Ⅶ的降低作用呈剂量依赖性。

图1 各组胰腺癌裸鼠移植瘤体积比较Figure 1 Comparison of the volume of xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice

2.2 重楼皂苷Ⅶ降低胰腺癌裸鼠移植瘤质量表1结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌裸鼠移植瘤质量均显著降低（P＜0.01），且重楼皂苷Ⅶ的降低作用呈剂量依赖性。

表1 各组胰腺癌裸鼠移植瘤质量比较Table 1 Comparison of the mass of xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice（±s）

①P＜0.01，与对照组比较

组别对照组重楼皂苷Ⅶ低剂量组重楼皂苷Ⅶ中剂量组重楼皂苷Ⅶ高剂量组5-氟尿嘧啶组鼠数（只）10 10 10 10 10移植瘤质量（g）0.50±0.03 0.40±0.05①0.24±0.03①0.11±0.03①0.06±0.02①

2.3 重楼皂苷Ⅶ促进胰腺癌裸鼠移植瘤组织细胞凋亡移植瘤组织TUNEL阳性表达细胞胞核呈棕色深染，结果如图2所示。表2结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌裸鼠移植瘤组织TUNEL阳性细胞比例均显著升高（P＜0.01），且重楼皂苷Ⅶ的升高作用呈剂量依赖性。

图2 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织TUNEL阳性细胞分布（TUNEL染色法，×200）Figure 2 Comparison of the distribution of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice（by TUNEL staining，×200）

表2 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织TUNEL阳性细胞比例比较Table 2 Comparison of proportion of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

表2 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织TUNEL阳性细胞比例比较Table 2 Comparison of proportion of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

①P＜0.01，与对照组比较

组别对照组重楼皂苷Ⅶ低剂量组重楼皂苷Ⅶ中剂量组重楼皂苷Ⅶ高剂量组5-氟尿嘧啶组鼠数（只）10 10 10 10 10 TUNEL阳性细胞比例（%）2.1±0.3 8.8±0.9①19.5±2.3①36.1±4.2①45.3±4.8①

2.4 重楼皂苷Ⅶ上调胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达

表3、图3结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ低、中、高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax蛋白水平均显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白水平均显著降低（P＜0.01），且重楼皂苷Ⅶ对Caspase-3、Bax蛋白的升高作用或对Bcl-2蛋白的降低作用呈剂量依赖性。

图3 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白免疫印迹电泳条带Figure 3 Comparison of Western blotting strips of caspase-3，Bax and Bcl-2 in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice

表3 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of the expression levels of Caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

表3 各组胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of the expression levels of Caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

①P＜0.01，与对照组比较

组别对照组重楼皂苷Ⅶ低剂量组重楼皂苷Ⅶ中剂量组重楼皂苷Ⅶ高剂量组5-氟尿嘧啶组鼠数（只）10 10 10 10 10 Caspase-3/GAPDH相对表达量0.08±0.01 0.23±0.04①0.51±0.10①1.02±0.05①1.22±0.03①Bax/GAPDH相对表达量0.10±0.02 0.25±0.04①0.43±0.05①0.98±0.12①1.31±0.11①Bcl-2/GAPDH相对表达量0.86±0.09 0.55±0.07①0.45±0.05①0.22±0.03①0.10±0.02①

3 讨论

胰腺癌形成目前被认为是受多因素、多基因、多步骤调控，内外因相互作用的复杂过程[11]。胰腺癌的5年生存率＜5%，中位生存期不到6个月[12]。虽然，目前对胰腺癌的流行病学、发病机制和诊断治疗有了更深入的了解，但各种治疗方法的效果差，主要是因为胰腺解剖、生理特点的特殊性，早期发现和手术切除困难，化疗不敏感[13]。5-氟尿嘧啶是最早用于治疗胰腺癌的化疗药物，但5-氟尿嘧啶的耐药性在临床上广泛存在[14]。因此，需要探寻新型有效的抗胰腺癌药物。中药是用于治疗癌症的最常用的补充和替代药物之一[15-17]。中药重楼常用于治疗癌症[18]，其生物活性成分主要为多种甾体皂苷类。从中分离得到的重楼皂苷Ⅶ已被证明具有很强的抗癌活性[6-9，19]。

细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，在人类发育和组织稳态中起重要作用。越来越多的证据表明细胞凋亡与癌症的存活密切相关，已成为发现和开发新型抗癌药物的关键目标[20]。研究[21-22]发现，通过促进细胞凋亡可抑制胰腺癌细胞的生长。本研究结果显示，重楼皂苷Ⅶ可降低裸鼠移植瘤体积、质量，促进裸鼠移植瘤细胞凋亡，表明重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌裸鼠移植瘤生长具有抑制作用。

细胞凋亡分为外源性凋亡途径、内源性凋亡途径和内质网应激途径[23]。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，可以通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡，Caspase家族成员Caspase-3是细胞凋亡过程中的主要效应因子[24]。蒲凤萍等[25]研究发现，升高Caspase-3活性可促进胰腺癌细胞凋亡。本研究结果表明，重楼皂苷Ⅶ能上调胰腺癌裸鼠移植瘤组织Caspase-3蛋白的表达。

内在凋亡途径中的关键事件是线粒体外膜的透化，其响应于各种刺激而发生，并且受若干细胞质蛋白调节，包括Bcl-2家族成员[26]。抗细胞凋亡成员Bcl-2，可防止细胞凋亡；而促凋亡成员Bax位于线粒体外膜或细胞质，并在应激下寡聚化，促进线粒体释放因子，从而引发细胞凋亡[27]。Zhang等[28]研究发现，下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达可促进BxPc-3人胰腺癌细胞凋亡。王云检等[29]研究发现，促进Bax表达、降低Bcl-2/Bax的比值可对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤有促凋亡作用。本研究结果表明，重楼皂苷Ⅶ能上调胰腺癌裸鼠移植瘤组织Bax、下调Bcl-2蛋白表达。

综上所述，重楼皂苷Ⅶ可有效抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长，其机制可能与上调Caspase-3、Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达、从而促进细胞凋亡有关。本研究结果展示了重楼皂苷Ⅶ治疗胰腺癌的潜力，该药值得进一步深入研究和挖掘，尤其是要针对其耐药性监测的问题。