探针扩增阻滞突变法与数字PCR法检测甲状腺乳头状癌BRAF基因突变

荀延萍，姜燕平，傅佳仪，张仕蓉

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲状腺癌中最常见的类型，约占甲状腺癌的90%[1]。虽然目前绝大多数PTC预后较好，但仍有30%的PTC患者术后出现反复复发及远处转移[2]。Kimura等[3]研究发现70%的PTC可能存在分子改变，包括编码受体酪氨酸激酶RET、神经营养受体酪氨酸激酶-1(NTRK1)基因，以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的两个细胞内效应基因RAS和BRAF。BRAF作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路，可以调控细胞的增殖、分化以及凋亡[4]，在PTC中BRAF突变率最高，其中45%为V600E，其次为K601E和V599Ins[5-7]。BRAF V600E突变是PTC中最常见的一种遗传改变，可能通过侵袭性行为影响肿瘤的发展，因此BRAF突变已成为一种潜在的PTC预后分子标记[8]，是目前PTC中分析和检测的热点。本实验应用探针扩增阻滞突变(amplification refractory mutation system, ARMS)法和数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法检测BRAF V600E突变，分析比较哪种方法更适用于PTC组织中BRAF V600E突变检测。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2018年8月～2019年8月浙江省杭州市第一人民医院存档的PTC手术标本371例。患者中位年龄49岁，男性98例，女性273例。所有标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、组织切片后病理医师复阅切片明确诊断，并评估肿瘤细胞含量后进行检测。本组所有患者均知情同意。

1.2 DNA提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒(Qiagen公司生产，货号56404)提取石蜡包埋组织样本基因组DNA，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。并用微量分光光度计测定DNA浓度及纯度，以OD260/OD280处于1.8～2.0之间，浓度均﹥10 ng/μL为合格。提取后的DNA样品在-20 ℃条件下保存待用。

1.3 ARMS法检测基因突变使用人BRAF基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(北京雅康博生物公司，TB004)检测石蜡包埋组织样本中BRAF基因V600E点突变，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。……