安卡红曲霉As 3.4811液态发酵制备膳食纤维的特性研究

吴学凤，陈明鑫，孙聪聪，穆冬冬，陈小举，田宝东，蒋俊树，姜绍通，李兴江*

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥 230009；2.巢湖学院化学与材料工程学院，安徽巢湖 238000；3.汇福粮油泰州公司，江苏泰州 225300；4.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051）

我国农产品废渣产量巨大，一般仅作为肥料、饲料使用，或者直接丢弃，造成了资源浪费和环境污染。废渣中含有大量的营养物质如碳源、氮源和矿物质等，其中膳食纤维含量丰富，是提取高品质膳食纤维的廉价原料[1]。因此，如何高效、高值利用农产品废渣中的膳食纤维成为了近年来的研究热点。

膳食纤维（dietary fiber，DF）主要由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和树胶等物质组成[2]，分为可溶性膳食纤维（solubledietaryfiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insolubledietary fiber，IDF）。DF具有抗癌、抗氧化、降低胆固醇、预防心血管疾病等作用[3-4]。DF的制备方法主要有酸法、碱法、酶法和发酵法。其中发酵法是利用微生物降解原料中植酸、大分子多糖、蛋白质等物质，以其环境友好特点备受关注[5-6]。

红曲霉是一种非致病性丝状腐生真菌，在发酵过程中能产生Monacolin K、红曲色素、γ-氨基丁酸等功能性物质，还有淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等各种酶类[7]。本研究以豆渣、麦麸和梨渣为原料，利用红曲霉菌发酵生产集红曲色素及DF保健功能于一体的红曲膳食纤维，并对其进行结构表征，以期为农产品废渣的精深加工和综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

HNY-100Y恒温摇床培养箱：恒立国际有限公司；Jeol JSM-6490LV扫描电子显微镜：日本电子制造；D/MAX 2500V型X-射线衍射仪：日本电子制造；Thermo Nicolet 67红外光谱仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；E2695高效液相色谱仪：上海沃特斯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣、麦麸、梨渣膳食纤维的制备

（1）发酵法：按照参考文献[8]，采用红曲霉发酵法、酶法（对照样品）制备DF。红曲霉发酵豆渣、麦麸、梨渣，分别得到安卡红曲豆渣SDF（Monascusokara soluble dietary fiber，MOSDF）、红曲麦麸SDF（Monascuswheat bran soluble dietary fiber，MBSDF）、红曲梨渣SDF（Monascuspear residue soluble dietary fiber，MPSDF）、红曲豆渣IDF（Monascusokara insolu ble dietary fiber，MOIDF）、红曲麦麸IDF（Monascuswheat bran insoluble dietary fiber，MBIDF）和红曲梨渣IDF（Monascuspear residue insoluble dietary fiber，MPIDF）。将提取的SDF和IDF混合，即得红曲豆渣膳食纤维（Monascusokara dietary fiber，MODF）、红曲麦麸膳食纤维（Monascuswheat bran dietary fiber，MBDF）和红曲梨渣膳食纤维（Monascuspear residue dietary fiber，MPDF）。

（2）酶法：酶法制备的DF作为对照组，分别得到豆渣SDF（okara soluble dietary fiber，OSDF）、麦麸SDF（wheat bran soluble dietary fiber，BSDF）、梨渣SDF（pear residue soluble dietary fiber，PSDF）、豆渣IDF（okara insoluble dietary fiber，OIDF）、麦麸IDF（wheat bran insoluble dietary fiber，BIDF）和梨渣IDF（pear residue insoluble dietary fiber，PIDF）。将提取的SDF和IDF混合，即得豆渣DF（okara dietary fiber，ODF）、麦麸DF（wheat bran dietary fiber，BDF）和梨渣DF（pear residue dietary fiber，PDF）。

1.3.2 X-射线衍射检测方法

按照参考文献[9]的方法对OIDF、MOIDF、BIDF、MBIDF、PIDF和MPIDF进行衍射图谱分析。测量条件：18 kW台式高频X射线发生器旋转靶，管压40 kV，扫描范围5～60°，步长0.02°，X衍射线来自于铜。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱检测方法

早晨，苏穆武在和票友在唱京剧。苏穆武唱的是《马前泼水》朱买臣的一段：走上前来苦哀告，贤妻且把怒气消……

按照参考文献[10]的方法进行测定。将样品与溴化钾粉末混合，在4 000～400 cm-1的波数区域内读取光谱，检测器分辨率为1.0 cm-1。

1.3.4 扫描电子显微镜检测方法

按照参考文献[11]的方法，使用扫描电子显微镜观察红曲霉菌丝体和IDF的形态。将样品置于导电条上，并通过在真空蒸发器中连接到溅射涂层的蒸发器，用细金层覆盖。电子显微镜设定为20 kV的电压。观察样品的放大倍数为500×和1 000×。

1.3.5 红曲色素的检测方法

按照参考文献[12]的方法，以乙醇作为空白对照，利用双光束紫外可见分光光度计记录红曲霉种子液（Monascusseed broth，MSB）红曲霉豆渣发酵液（Monascusokara fermentation broth，MOFB）、红曲霉麦麸发酵液（Monascuswheat branfermentationbroth，MBFB）和红曲霉梨渣发酵液（Monascuspearresiduefermentationbroth，MPFB）中的红曲色素在300nm至600 nm波长范围内的吸收光谱，确定光密度值（optical density，OD），将OD值乘以稀释倍数即为红曲色素的色价。

1.3.6 橘霉素含量的测定[13]

使用C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定橘霉素含量。试验条件：双二极管阵列检测器，检测波长为222 nm，设定波长为200～500 nm，柱温为28 ℃，乙腈∶超纯水（3∶1，V/V，磷酸调节至pH 2.5）作为流动相，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，进样时间为20 min。橘霉素含量计算公式如下：

式中：C为HPLC测定的MSB、MOFB、MBFB和MPFB中的橘霉素质量浓度，mg/L。

1.3.7 数据处理与统计分析

所有实验重复3次，使用SPSS软件V19.0进行统计分析。使用Duncan检验，认为P＜0.05表示统计学显著性。

2 结果与分析

2.1 IDF的结晶结构分析

DF的结晶结构直接影响其物理和化学性质，例如持水性、持油性和膨胀性[14]。由图1可知，对照组IDF和红曲霉发酵样品IDF在衍射方向21.8°附近均有强衍射峰，豆渣、麦麸和梨渣IDF具有典型的纤维素Ⅰ型晶体结构。X-射线衍射图谱中的峰越尖表明样品的结晶度越高，样品的拉伸强度和硬度也越大[15]。空白对照IDF比红曲霉发酵处理的IDF的峰更尖锐，表明红曲霉发酵处理降低了豆渣、麦麸和梨渣IDF的结晶度。红曲霉发酵降解农产品废渣中的植酸、大分子多糖、蛋白质、脂肪等营养物质，从而使废渣的完整结构被破坏，内部结构的暴露促进了结晶区域中的酶水解是IDF结晶度降低的主要原因[16]。

图1 豆渣、麦麸和梨渣不溶性膳食纤维的X-射线衍射图Fig.1 X-ray diffraction diagrams of insoluble dietary fiber from okara,wheat bran and pear residue

2.2 豆渣、麦麸和梨渣DF红外光谱分析

2.2.1 豆渣DF的红外光谱分析结果

由图2可知，3 300 cm-1、2 913 cm-1、1 628 cm-1、1 370 cm-1、1 028 cm-1和892 cm-1波数处的谱带是纤维素的特征峰，分别对应于CH2，C-H，C-O-C，OH，C-C-H和C-O-H振动。经红曲霉发酵后，MOSDF和MOIDF在波数3 300 cm-1处的谱带变宽，表明纤维中存在氢键[17]，MODF中含水量增加。在波数1 028 cm-1处的谱带是DF中低聚糖的吸收峰，而DF中的β-糖苷键则引起红外光谱波数892 cm-1处的伸缩振动[18]，表明发酵后低聚糖减少，β-糖苷键变化不明显。

图2 豆渣可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from okara

2.2.2 麦麸DF的红外光谱分析结果

由图3可知，红曲霉发酵制备的SDF和IDF与对照相比，峰强度降低，且峰向低波数移动，说明了多糖的降解、纤维素和半纤维素分子内氢键断裂。波数2 924 cm-1的条带归因于来自多糖亚甲基的C-H伸缩带。波数1 638 cm-1处的峰值是由于木质素的芳烃的弯曲或拉伸。MBIDF在该处的峰强度变弱，说明了木质素的降解[19]。BSDF和BIDF在波数1 050 cm-1处有吸收峰，这是寡糖的吸收峰。MBSDF和MBIDF在该处峰强度增大，说明了发酵后DF中的多糖大分子降解成小分子糖。

图3 麦麸可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from wheat bran

2.2.3 梨渣DF的红外光谱分析结果

由图4可知，MPSDF、PSDF、MPIDF和PIDF均具有波数3 249 cm-1处的宽带，这归因于多糖的O-H的伸缩振动峰。波数2 930 cm-1的条带归因于来自多糖亚甲基的C-H伸缩振动。波数1 623 cm-1处的峰值是由于木质素的芳烃的弯曲或拉伸。MPIDF在该处的峰强度变弱，说明了木质素的降解。在波数1 233 cm-1附近处的吸收峰是结晶吸收带，MPSDF和MPIDF在该处的吸收峰明显增强。PSDF和PIDF在波数1 014 cm-1处有吸收峰，这是寡糖的吸收峰，说明PDF中含有吡喃糖环[20]。

图4 梨渣可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from pear residue

2.3 微观结构分析

由5（a）可知，红曲霉菌丝细长并且具有透明的管状结构。这些菌丝相互交织，形成网络结构。由图5（b）和图5（c）可以看出，OIDF具有较大的颗粒，松散的片状结构，波纹表面和致密的结构，从而赋予了膳食纤维良好的持水性，保油性和溶胀性。MOIDF的形状不规则，结构疏松多孔，表面更粗糙，同时呈现出蜂窝状。MOIDF颗粒的结构比表面积更大，羟基也更多，这与FI-IR光谱结果一致。从图5（d）可以看出，BIDF具有规则的形状和大小，且纤维表面完整致密。而MBIDF结构疏松，表面突出不规则，边缘粗糙且出现大量的微孔，IDF的层状结构遭到破坏。红曲霉液态发酵处理促进了麦麸中IDF表面的破裂和脱离，导致纤维基质不连续且松散，使其暴露出大量的内部结构[21]。从图5（f）和5（g）可以看出，发酵法和酶法制备的梨渣IDF结构都受到破坏，无完整纤维颗粒，经红曲霉发酵处理的IDF表面褶皱和纹路增多。因此，红曲霉液态发酵使豆渣、麦麸和梨渣IDF结构改变，比表面积和结构孔隙率增大，有助于提高DF的水合性能。这与IDF的结晶结构和分子结构分析结果相一致[22]。

图5 红曲霉菌丝体和农产品废渣不溶性膳食纤维的扫描电子显微镜图Fig.5 Scanning electron microscope image of Monascus mycelium and insoluble dietary fiber from agricultural product waste

2.4 红曲豆渣、麦麸和梨渣中红曲色素的成分分析

图6（a）是MSB的全波长扫描图，其特点是有三个吸收峰，分别对应为红色素（532 nm）、橙色素（410 nm）和黄色素（370 nm）。图6（b）是MOFB的全波长扫描图，具有两个吸收特征峰，分别为红色素和橙色素吸收峰，其中来自红曲豆渣的红曲色素中橙色素峰值处的色价显著高于在红色素峰值处的色价。图6（c）是MBFB的全波长扫描图，具有红色素（532 nm）和黄色素（370 nm）两个吸收峰。从图6（d）可以看出，MPFB的全波长扫描显示有三个特征吸收峰，分别对应于红色素（532 nm）、橙色素（410 nm）和黄色素（370 nm）。

图6 不同发酵液中红曲色素的全波长扫描曲线Fig.6 Full-wavelength scanning curves of Monascus pigments in different fermentation broths

红曲色素的色价与其含量成正相关[23]。因此，通过测量红曲色素的色价可以分析红曲霉发酵豆渣、麦麸和梨渣产生红曲色素的含量。由表1可知，MSB中红色素、橙色素和黄色素的含量均较低。MOFB中含有红色素和橙色素，橙色素含量远高于红色素含量，其色价分别为258.8 U/mL和140.2 U/mL。MBFB中含有红色素和黄色素，其色价分别为154.4 U/mL和236.6 U/mL。MPFB含有红色素、橙色素和黄色素，其中红色素和黄色素色价较低，橙色素色价最高，为248.2 U/mL。由此可见，发酵底物影响红曲色素成分，采用不同农产品废渣可以获得不同组分的红曲色素。

表1 豆渣、麦麸和梨渣对红曲色素成分的影响Table 1 Effect of okara,wheat bran and pear residue on the Monascus pigments compositions

续表

2.5 不同发酵液中橘霉素含量的测定

红曲霉在发酵过程中不仅产生红曲色素等有益物质，还会产生一些有毒物质，其中橘霉素是红曲发酵的关键毒素。橘霉素具有高毒性，对肾脏特别有害，会导致动物肾脏肿大和上皮细胞坏死等[24]，因此，必须对发酵产生的橘霉素含量进行监控。根据国标规定，食品中的橘霉素含量不得超过0.05 mg/kg（或mg/L）[25]。在本研究中，通过HPLC测出MSB、MOFB、MBFB和MPFB中橘霉素含量分别为0.009 8 mg/L、0.009 4 mg/L、0.008 8 mg/L和0.009 0 mg/L，符合国家标准要求。

3 结论

以豆渣、麦麸和梨渣为底物，进行红曲霉液态发酵，不仅能够增加农产品废渣中SDF的含量，改善DF的品质，还可产生红曲色素等多种次级代谢物，增加产品的保健功能，提高农产品废渣的利用价值。本研究采用安卡红曲霉发酵豆渣、麦麸和梨渣，制备膳食纤维，并研究了红曲霉发酵对膳食纤维结构组成的影响。研究结果表明，红曲霉发酵可以改变豆渣等农产品废渣的膳食纤维内部结构，从而有效改善膳食纤维的理化特性，有利于提高其在食品等领域的应用价值。后期应对红曲霉发酵机理及红曲膳食纤维的组分及结构进行详细研究。