青海省不同地区羌活挥发性成分AOE含量的测定

李容榕，盛观星，林小艳

（1.青海民族大学药学院，青海西宁 810007；2.青海省青藏高原植物化学重点实验室，青海西宁 810007）

羌活，又称“护羌使者”，为伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting exH.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium foriesii Boiss的干燥根茎[1]。羌活为常用中、藏药材，许多中、藏医典籍均有记载，其味辛、苦，性温，具有解表散寒、祛风除湿、止痛活血等功效。临床用于改善胃肠消化吸收功能、治疗妇科疾病、风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛等病证[2]。现代药理学研究，羌活具解热、镇痛、抗炎、抗过敏、抗病毒、增加脑血流量、抗血小板凝集、抗心肌缺血、抗心律失常、抗哮喘、抗海洋污损活性等作用[3-9]。羌活化学成分种类繁多、成分复杂，主要含有挥发油和香豆素类化合物，此外还有氨基酸、有机酸、多糖、微量元素等[10-12]。

AOE 即植物抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等，是普遍存在于植物各种组织中的复合酶系。与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料与试剂

实验所用药材，经青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定，为伞形科羌活属植物羌活及宽叶羌活。2018 年6-8 月分别采自青海省互助北山林场（2 种）、大通县、祁连县3个地区，4种。弃去植株根部以上部位，用纯水冲洗根部、阴干，粉碎，过40目筛，备用。

甲醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；RO纯水（自制）。96T 植物抗氧化酶（AOE）活性酶联免疫分析试剂盒（江苏麦莎实业有限公司，LOT NO：18112808H）。

1.2 仪器

FLUOstar Omega 全自动多功能酶标仪（德国BMG LABTECH 公司）；GZX-9076MBE 型数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；UPHIV-10T 型优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）；AL204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KDM 型调温电热套（西安森海石油设备有限公司）；Spe-ed SFE-4 超临界流体萃取装置（美国ASI应用分离公司）；FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SDC-6 型低温恒温槽（南京新辰生物科技有限公司）；挥发油提取器（上海申玻仪器公司）；40 目标准筛（绍兴市上虞新达净化仪器厂）。

2 方法

2.1 羌活挥发性成分提取

超临界CO2萃取法：取备用样品20 g 置于超临界CO2萃取釜中，压力360 MPa、温度50 ℃条件下，静态萃取15 min，动态萃取45 min，得不同地区羌活萃取物。

水蒸气蒸馏法：取备用样品20 g 置于圆底烧瓶中，按照《中国药典（2015 版）》挥发性成分提取项下仪器组装，进行提取。

提取得率、颜色等状态详见表1。

表1 不同地区羌活挥发性成分颜色及提取率

2.2 样品处理

取上述提取所得挥发性成分（编号QH1-QH8）适量于70%甲醇中，配制为5.0 mg/mL溶液，备用。

2.3 标准曲线绘制

取所购买植物抗氧化酶（AOE）试剂盒中原倍标准品，按照表2进行稀释。

分别设空白孔与标准孔。在酶标包被板上，标准孔内分别准确加入1号至5号标准品50 μL于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀。

封板膜封板后置于37 ℃环境中温育30 min。揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。

洗涤结束后，空白孔除外，每孔加入酶标试剂50 μL。用封板膜封板置37 ℃环境中温育30 min。取出，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。

洗涤结束后，每孔中先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，震荡混匀，37 ℃避光环境中温育、显色15 min 后，每孔中加入终止液50 μL，终止显色反应，此时蓝色立即转为黄色。

孔板置于酶标仪，调零，反应终止15 min 内，450 nm 波长下依序测量各孔的吸光度（OD值）。

标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线得出线性回归方程式。

2.4 样品测定

待测样品孔中加入样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。后续步骤同标准曲线的绘制的方法。

3 结果

3.1 标准曲线及回归方程

植物抗氧化酶（AOE）含量测定标准曲线线性回归方程为：y=0.0813x+0.0245，r2=0.9997。曲线见图1。

图1 植物抗氧化酶（AOE）含量标准曲线

3.2 精密度实验

按照上述操作步骤，重复测定5 次，结果显示待测样品的植物抗氧化酶（AOE）含量的RSD为0.7%～1.6%，表明该方法精密度良好。

3.3 重复性实验

按照上述操作步骤，称取同一待测样品5份进行测定，结果显示待测样品植物抗氧化酶（AOE）含量的RSD为0.8%～1.7%，表明该方法重复性良好。

3.4 样品测定结果

水蒸气蒸馏法得挥发性成分中植物抗氧化酶（AOE）含量较高，超临界CO2萃取法的挥发性成分中植物抗氧化酶（AOE）含量较低。各样品中植物抗氧化酶（AOE）含量见表3。

表3 不同地区羌活挥发性成分植物抗氧化酶（AOE）含量表

4 结论

实验结果表明：水蒸气蒸馏得羌活挥发性成分中植物抗氧化酶含量明显高于超临界CO2萃取法所得羌活挥发性成分。水蒸气蒸馏羌活挥发性成分中，不同地区之间的植物抗氧化酶含量有较大差异，采自青海省互助北山林场的羌活AOE 含量最高，达9.99 U/g，其次是祁连县宽叶羌活、互助北山林场宽叶羌活，采自青海省大通县的羌活植物抗氧化酶（AOE）含量最低，为5.09 U/g。超临界CO2萃取得青海省不同地区羌活挥发性成分的AOE 含量无明显差异，均低于4.00 U/g。

水蒸气蒸馏法提取得到的羌活挥发性成分中AOE含量高，超临界CO2萃取法提取的羌活挥发性成分AOE 含量较低，且无明显地区差异性。采用不同提取方法、不同提取溶剂选择，对提取物成分、含量、状态均有明显影响，尤其对羌活挥发性成分AOE 提取率有显著影响。与超临界CO2萃取法相比，水蒸气蒸馏法传统、经典，且提取溶剂是水蒸气，得到的挥发性成分中除挥发油外脂溶性成分含量极低，AOE含量较高。

AOE 含量可以较好地反映出不同地区羌活抗氧化活性的强弱，同时反映出不同提取方法对植物抗氧化酶提取的影响。