响应面法优化超声强化黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺

石 峰， 李 佥， 田 晶， 费 旭， 刘 向 丽， 罗 健， 张 楠， 陈 高 俊

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034； 2.大连工业大学 分析中心, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

柚苷酶是一种重要的生物酶制剂[1]，由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成。柑橘类果汁加工过程中常用柚苷酶进行酶法脱苦，从而改善饮品的风味[2]。α-L-鼠李糖苷酶可将柚柑类果汁中的黄烷酮糖苷类化合物——柚皮苷(苦味较大)水解成鼠李糖和普鲁宁(苦味较小)，普鲁宁可在β-D-葡萄糖苷酶的继续作用下生成柚皮素(无苦味)和葡萄糖，使果汁脱苦[3]。近年来，随着研究的不断深入，柚苷酶开始被广泛应用于食品和医药工业[4]。

研究表明，超声刺激能够有效提高相关酶的产量[5-6]。但目前应用超声刺激强化柚苷酶发酵酶活的相关研究鲜有报道。本实验采用超声刺激对黑曲霉发酵产柚苷酶过程进行研究，并通过响应曲面法对相关操作参数进行优化，获得最佳工艺条件，为深入研究新型柚苷酶发酵策略，促进生物食品酶及生物催化的产业化发展提供基础数据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑曲霉FFCC uv-11，大连工业大学菌种保藏中心提供；柚皮苷，宝鸡市方晟生物开发有限公司；脱脂豆粉，大连调味食品厂；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 培养条件

将低温保存的黑曲霉菌种转接至斜面培养基上，30 ℃恒温培养3 d后，取孢子接种于种子培养基中，30 ℃、180 r/min培养48 h后接种到发酵培养基。改良后的发酵培养基组成(L)[7]：KH2PO4·2H2O 1.5 g，K2HPO4·12H2O 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，(NH4)2SO44.0 g，ZnSO4·7H2O 0.09 g，CaCl20.1 g，豆粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.0 g，柚皮苷6.0 g；pH 6.0。

1.3 酶活力测定方法

使用Davis法测定发酵培养基中柚苷酶活力[8-9]。柚苷酶活力定义：在pH 4.5、50 ℃条件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量为1个酶活性单位(U/mL)[7]。

1.4 超声对黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化

1.4.1 超声工艺

使用超声波清洗机(频率固定为40 kHz)对发酵摇瓶进行间歇性超声处理，并通过冷却水循环系统控制超声水浴温度为30 ℃。以未超声处理的试验组为对照组，研究不同超声参数对柚苷酶发酵酶活力的影响。

1.4.2 单因素试验

1.4.2.1 超声时期的确定

分别在发酵18、24、30、36、42 h时进行超声，功率150 W，时长5 min，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶活力。

1.4.2.2 超声功率的确定

在最佳超声时期，分别在超声功率125、150、175、200、225 W时进行超声，时长5 min，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶活力。

1.4.2.3 超声时长的确定

在其他最佳条件下，分别进行3、5、10、15、20 min 超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。

1.4.2.4 超声次数的确定

在其他最佳条件下，分别进行1～4次超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。

1.4.2.5 超声时间间隔的确定

在其他最佳条件下，分别间隔6、12、18、24 h进行两次超声，每组试验3个平行，发酵结束后测定柚苷酶发酵酶活力。

1.4.3 响应面法优化发酵工艺

在单因素试验基础上，通过响应面分析法和Box-Behnken设计试验，以柚苷酶活力作为响应值，以超声时期(A)、超声功率(B)、超声时长(C)、超声次数(D)、超声时间间隔(E)进行五因素三水平的Box-Behnken试验设计，采用响应曲面法分析各因素对响应值的影响。试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平表Tab.1 Code and true values of variables of the Box-Benhnken design models

2 结果与讨论

2.1 超声时期对柚苷酶活的影响

如图1所示，在黑曲霉发酵18 h进行超声，柚苷酶活最低，这可能是因为在发酵前期进行超声处理使微生物发酵的延滞期延长，相对生长速率降低，从而影响发酵产物的产生。发酵30 h进行超声时，发酵终点柚苷酶活达到最大，为918.3 U/mL。发酵时间持续延长，柚苷酶活有所下降，因此确定最佳超声时期为菌体发酵30 h。

图1 超声时期对柚苷酶活的影响Fig.1 Effect of ultrasonic stimulation stage on naringinase activity

2.1.2 超声功率对柚苷酶活的影响

如图2所示，随着超声功率的增大，柚苷酶活不断增加，当超声功率为175 W时，柚苷酶活达到最大。而进一步增大超声功率，柚苷酶活快速降低，可能是因为超声功率的增加使得空化作用加强，较强的空化作用会对菌体造成损伤，导致菌体产酶能力降低[10]，这与张泽栋等[11]的研究结果相似，因此选取175 W为最佳超声功率。

图2 超声功率对柚苷酶活的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on naringinase activity

2.1.3 超声时长对柚苷酶活的影响

如图3所示，在超声功率一定的情况下，随着超声时长的增加，柚苷酶活不断增加，当超声时长为10 min时，柚苷酶活达到最大。当超声时长继续延长时，柚苷酶活显著降低，这可能是因为过度的超声会造成细胞损伤[12]，导致产酶能力下降。因此选取10 min为最佳超声时长。

图3 超声时长对柚苷酶活的影响Fig.3 Effect of the ultrasonic duration on naringinase activity

2.1.4 超声次数对柚苷酶活的影响

如图4所示，当超声次数为2时，柚苷酶活达到最高，继续增加超声次数，柚苷酶活降低。这可能是由于适当的超声能够促进菌丝体的生长和次级代谢产物的合成，但多次刺激会对细胞膜造成损伤[13]，因此确定最佳超声次数为2。

图4 超声次数对柚苷酶活的影响Fig.4 Effect of ultrasonic times on naringinase activity

2.1.5 超声时间间隔对柚苷酶活的影响

如图5所示，当超声时间间隔为12 h时柚苷酶活达到最大，继续延长超声时间间隔会导致柚苷酶活的降低，这可能是由于超声时间间隔的延长使得菌体对超声的反应减弱，进而导致柚苷酶活的下降。因此确定最佳超声时间间隔为12 h。

图5 超声时间间隔对柚苷酶活的影响Fig.5 Effect of ultrasonic interval on naringinase activity

2.2 响应面法优化工艺

以超声时期(A)、超声功率(B)、超声时长(C)、超声次数(D)、超声时间间隔(E)为试验因素，以柚苷酶活为响应值进行五因素三水平的Box-Behnken设计，采用响应曲面法对超声强化柚苷酶活的工艺进行优化。Box-Behnken设计由46个试验组组成，包括40个因子点和6个中心点，响应面试验方案及结果如表2所示。

表2 响应曲面试验方案与结果Tab.2 Experimental scheme and results of RSM

2.2.1 数学模型建立

使用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归拟合，得到柚苷酶活与各因素间的二元回归方程：

N=1 058.34+4.36A-6.60B+8.21C+

0.34D-4.81E-0.12AB-11.24AC-

23.14AD+7.17AE-10.26BC-

15.84BD-9.13BE+10.14CD+

5.74CE+11.00DE-29.06A2-

32.09B2-15.14C2-14.64D2-7.74E2

2.2.2 方差分析

由表4可知，对响应值产生影响的5个因素对柚苷酶活的影响作用由大到小依次为B、C、E、A、D，其中B、C、E三项影响极显著(P<10-4)，A影响显著(P<0.05)，D影响不显著(P>0.05)；A、B、C、E各因素平方项对响应值的影响都达到极显著水平，所以超声时机、超声功率、超声时长和超声间隔时间对柚苷酶活的影响较大。

2.2.3 响应面分析

使用Design-Expert 8.0.6软件绘制出各因素对响应值影响的三维曲面图，如图6所示。可以看出，超声时期、功率、时长和时间间隔都存在相关性，所有的曲面图均为开口向下的凸面，并存在最高点，说明在试验考察范围内存在最大的柚苷酶活响应值。

表3 响应曲面回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of RSM regression equation

由图6(a)可以看出，当超声功率、超声次数和超声时间间隔为零水平时，随着A和C的增大，柚苷酶活呈现出先增高后降低的趋势；由图6(b)可以看出，当其余因素处于零水平时，随着A和E的增大，柚苷酶活达到最大酶活后快速降低，A、E表现出对柚苷酶活的非线性影响；由图6(c)可以看出，随着B和C的增大，柚苷酶活快速增大，后趋于平缓，响应曲面的坡度较陡，B、C对柚苷酶活的影响显著；图6(d)为C、E对柚苷酶活的交互影响。总体来说，各因素的交互影响效果明显，等高线都呈现椭圆形，说明该响应面优化设计能够合理反映出各因素对响应值的影响。

2.2.4 最佳超声工艺的确定和验证试验

最佳超声刺激工艺条件：超声时期27.25 h、超声功率160.12 W、超声时长14.43 min、超声次数2.83、超声时间间隔13.02 h，柚苷酶活的理论预测值最高可达1 064.19 U/mL。结合实际试验条件，确定超声强化黑曲霉发酵生产柚苷酶的最佳工艺参数为超声时机27 h、超声功率160 W、超声时长14 min、超声次数2次、超声间隔时间13 h。在该工艺条件下测得柚苷酶活为1 059.20 U/mL，与预测值非常接近。

图6 响应面分析各因素对柚苷酶活影响

Fig.6 Response surface plots of the effect of two-factor interaction on naringinase activity

3 结 论

对超声刺激强化黑曲霉发酵产柚苷酶过程进行了研究，通过响应曲面法进行试验设计，获得了最佳优化工艺：超声时期27 h、超声功率160 W、超声时长14 min、超声次数2次、超声时间间隔13 h，柚苷酶活达1 059.20 U/mL，与未进行超声的对照组相比提高了23.16%。