间接免疫荧光法检测血小板相关抗体新判读标准的建立和评价

杨细媚，万祥辉，黄超，付晶晶，刘志强，柯江维

（1.江西省儿童医院检验科，2.肿瘤医院检验科，江西 南昌 330006）

血小板具有复杂的抗原系统,包括与其它组织或细胞所共有的抗原,如ABO血型系统抗原和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)；血小板特异性抗原(human platelet antigen，HPA)等[1]，而输血，感染等因素可诱导机体产生血小板抗体，导致相应疾病的产生[2-3]。目前研究较多的血小板自身抗体有两类：一类是针对HLA类抗原的抗体，即血小板表面相关抗体 (platelet associated immunoglobulin,PAIg)；一类是针对血小板糖蛋白的血小板特异性抗体[4-5]。本研究采用修正判读标准后的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IIF)检测PAIg。现对新标准进行评估，确定其可靠性，了解其在免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)和红斑狼疮(lupus erythematosus,SLE)相关临床疾病中的诊断意义，及与流式细胞仪法(flow cytometry method,FCM)的符合率。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2020年全年江西省儿童医院确诊的ITP患儿261例，男154例，女107例，平均年龄3.51岁；SLE患儿50例，男8例，女52例，平均年龄12.69岁，为实验组。AA患儿50例为病例对照组，男19例，女31例，平均年龄5.38岁。正常体检儿童50例为正常对照组，男30例，女性20例，平均年龄3.50岁。

1.2 仪器与试剂 莱卡荧光显微镜。 BD FACSCantoⅡ流式细胞仪。血小板抗体间接免疫荧光法检测试剂盒购于欧蒙诊断试剂有限公司。CD61，FITC-IgG购于BD公司。

1.3 检测方法 IIF法检测PAIg，以修正前后的新旧标准进行两次判读，对两次结果进行统计学分析。然后用FCM检测PAIg，对两组方法检测的一致性进行分析。

1.3.1 IIF法检测PAIg按试剂说明书的检测方法进行操作。结果判读：将原来的判读标准“与阳性对照结果一致判断为阳性”修正为“血小板着染均一荧光，以荧光强度大于或等于阳性对照稀释3倍后的荧光强度判断为阳性”。

1.3.2 FCM检测PAIg抽取EDTA-K2抗凝血，分离富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)，用PBS洗涤3遍，-20℃保存待测。每管分别加入3μl鼠抗人CD61-PE，l0μl羊抗IgG-FITC单克隆抗体避光孵育15 min,PBS缓冲液洗涤后，离心5 min，再用4%的甲醛溶液重悬，以CD61对血小板设门上流式细胞仪检测。结果判断：采用CellQuestPro软件分析。

1.4统计学方法 采用SSPS 24.0统计软件对数据进行统计分析，对新旧两种判读标准进行配对χ2检验。IIF和FCM两种检测方法采用Kappa一致性分析及McNemer检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IIF检测PAIg在ITP和SLE诊断中的意义以临床诊断作为金标准，使用新的判读标准后，ITP和SLE患儿PAIg的阳性率分别从19.54%(51/261)上升到62.07%(162/261)和16.00%(8/50)上升到38.00%(19/50)。新旧标准的阳性率有统计学差异 (P=0.000)，总的诊断效率从45.01%上升到67.64%(P=0.000)。研究发现其中17例持续性和慢性ITP患儿治疗后PAIg阳性率为29.42%(5/17)，远低于急性组ITP患儿64.34%(157/244)，见表1。AA组中PAIg的阳性率从修正前的14.00%(7/50)上升到修正后的28.00%(14/50)，正常对照组中，修正标准前后均为1例阳性。

表1 IIF法检测PAIg新旧判读标准的方法学评价（%）

2.2 各组PAIg在两种方法中的一致性分析 IIF法在ITP患儿中PAIg阳性率为64.00%(32/50)，FCM法阳性率为74.00%(37/50)，IIF法与FCM法的符合率为88.00%。通过McNemer检验(P=0.125)，提示两种方法诊断情况一致;Kappa值为0.680，提示两种方法诊断结果存在一致性。IIF法在SLE患儿的阳性率为38.00%(19/50)，FCM法阳性率为34.00% (17/50)，IIF法与FCM法的符合率为84.00%。通过McNemer检验(P=0.727)，提示两种诊断方法无差异；Kappa值0.653提示两种方法诊断结果存在一致性。见表2。IIF在50例AA患儿中检出14例PAIg，FCM法检出12例，IIF法与FCM法的符合率88.00%。通过McNemer检验(P=0.375)，提示两种方法诊断情况一致，Kappa值为0.733，提示两种方法诊断结果一致性较好。正常对照组中，IIF法检出1例PAIg，FCM全阴，两种方法的符合率为98.00%。见表3。

表2 ITP组和SLE组两种检测方法的一致性分析

表3 AA组和正常对照组两种方法的一致性分析

3 讨论

ITP是儿童常见的出血性疾病之一，国内外研究报道血小板自身抗体的检测在ITP鉴别诊断和疗效中有较高的应用价值[6-8]。血小板抗体检测方法较多，常用的有血小板粘附免疫荧光实验(platelet adhesion immunofluorescence test,PAIFT)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，FCM等。PAIFT方法简单，是较早的敏感方法，1986年国际血小板血清学研讨会曾将其作为参考方法,并规定任何新的血小板抗体检测方法均应与其进行比较[9]。ELISA是现今国内外应用最普遍的方法，但其敏感性和特异性均较低。近年来FCM法检测PAIg在国内外临床逐步推广使用，比较成熟[10-11]。本研究采用IIF法，其原理类似PAIFT法，说明书的判读标准为“与阳性对照一致判为阳性”，故判读时以阳性对照的荧光强度为标准，与阳性对照一致判断为阳性，结果发现阳性率很低。通过与公司商讨对判读标准进行具体化解读：“血小板着染均一荧光，荧光模型与阳性对照一致，但荧光强度需进一步摸索，本研究以阳性对照稀释3倍的荧光强度进行判断”。阳性率得到大幅提升，且与FCM进行Kappa一致性分析得出两种方法的结果一致，符合率较好。本研究发现急性ITP患儿的PAIg阳性率明显高于慢性或者经过治疗后的，可能是由于治疗抑制了抗体的产生，导致抗体水平降低。由此可见，检测PAIg可成为鉴别急慢性ITP和随访患者的有用工具，与Salah Aref等[12]报道的结果一致。血小板相关抗原与其他细胞或组织存在共有抗原，故自身免疫性疾病如SLE患者体内亦可检测出PAIg[13]。本实验方法检测SLE组患儿的PAIg阳性率明显低于李敏等[14]的报道，可能原因在于本研究人群为SLE患儿，而其研究人群为SLE伴血小板减少的患者。SLE组检测PAIg阳性结果的荧光强度常强于ITP组患儿，推测SLE组患儿本身存在其他的自身抗体。AA组用IIF法检测的阳性率亦较高，但与FCM检测的阳性率接近，可见AA组出现的假阳性率不是由于方法学的原因导致。有研究报道[15]AA组患儿PAIg水平增高，表明这部分患者体内存在针对自身血小板抗原的自身免疫反应，还有研究报道[16]AA组患儿体内血小板抗体与多次输血有关。本研究AA组的14例患儿中有10例有2次以上输血史。总之，与FCM法比较，IIF法不需要对标本进行血小板富集，洗涤等前期处理，整个操作过程简单，耗时短，成本低廉。尤其针对血小板数量少的患儿来说更合适，因为IIF法检测PAIg所需标本量很少，且不受标本中血小板数量影响，提高了因采血困难和采血量大患儿家属的满意度。

本实验采用修正判读标准后，IIF法阳性率得到大的提升，但总的阳性率在ITP患儿中还有待提高，特异性较一般。而且因是人工判读，结果存在主观差异，难以标准化。但由于其操作简便，标本需要量少，患儿家属易于接受，与FCM的符合率较好，IIF更适合对ITP患儿的PAIg进行筛查诊断。