非小细胞肺癌患者化疗前后外周血p53、ToPo-Ⅱ、GST-π水平变化及与预后的关系

韩艳艳，是蔷，葛林林

（焦作煤业集团有限责任公司中央医院内科，河南 焦作 454000）

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，且近年来发病率逐渐呈上升趋势，其中最常见的病理类型为非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC），约占肺癌的85%[1]。化疗在肺癌治疗中占有重要地位,目前多采用联合化疗方案,但疗效不理想。多药耐药是肺癌化疗失败的根本原因,其耐药的产生往往是多基因、多途径的共同作用[2]。研究证实,肿瘤蛋白53(Tumor protein 53,p53)、谷胱甘肽-S-转移酶-π（Glutathion transferase-π，GST-π）、拓扑异构酶-Ⅱ（Topoisomerase-Ⅱ，Topo-Ⅱ）等是恶性肿瘤产生多药耐药的物质基础，是目前研究的热点检测指标[3]。p53是重要的抑癌基因之一，影响着人体基因组稳定性，在诱导细胞周期捕获、凋亡和DNA修复等多种生理功能中发挥作用[4]。GST-π是肿瘤及组织细胞中最常见的同工酶,能够催化机体内谷胱甘肽与亲电性化合物结合，与肿瘤的转移浸润耐药等多种生物学行为有关，是具有研究意义的肿瘤性标志物[5]。ToPo-Ⅱ是存在与真核细胞中的一种核酶，其可引起DNA的二维及三维结构改变，在DNA复制、转录、染色体分离及DNA重组中起主要作用[6]。本研究分析了NS CLC患者化疗前后外周血p53、ToPo-Ⅱ、GST-π表达，以及其与患者预后关系，探讨其临床价值，以期为临床诊治NSCLC提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2016年1月至2018年1月期间接受化疗的109例NSCLC患者，男、女例数分别为63例和46例，年龄50～70岁，平均（60.35±7.25）岁；病理类型：腺癌55例，鳞癌54例；临床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期47例，Ⅳ期37例。纳入标准：⑴符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南》中的NSCLC诊断标准[7]，且经病理活检确诊，病理资料完整；⑵未行抗肿瘤治疗；⑶配合完成了本研究的指标检测;⑷经医院伦理委员会通过，患者及家属了解并知情同意。排除标准：⑴伴其他恶性肿瘤病症；⑵无法有效配合研究或缺乏完整的病例资料；⑶感染、免疫或血液系统疾病；⑷其他类型肺癌患者。

1.2 化疗方法 所有患者均给予护心、护胃、护肝、止吐等预防性治疗。静脉滴注长春瑞滨（山西普德药业股份有限公司，国药准字H20041467）25mg·m-2，d1和d8；静脉滴注顺铂（齐鲁制药有限公司,国药准字H37021362）75mg·m-2，d1～d3，以21d为1个周期，化疗4个周期。

1.3 主要试剂 RNA抽提试剂Trizol（广州泰勒生物科技有限公司）；兔抗人p53、GST-π及ToPo-Ⅱ抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；通用型二步法检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）溶液（广东省广州市美景生物科技有限公司）；DAB显色试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京中科瑞泰生物科技有限公司）。

1.4 标本采集 化疗前后，采集所有患者清晨空腹静脉外周血，加入肝素钠抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），取中间灰白色层，PBS洗涤2次后留取PBMCs备用。

1.5 免疫印迹法（Western blot）检测 取各组PBMCs，加入适量RIPA全蛋白裂解液提取总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，行10%SDS-PAGE电泳后转膜，加5%脱脂奶粉37℃封闭1 h后，加入p53、ToPo-Ⅱ、GST-π一抗（稀释浓度均为1∶1 000）后4℃摇床过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗膜，曝光，显影。最后用Quantity-one图像软件对结果进行分析及光密度值扫描，分别计算出目的蛋白条带与GAPDH的强度，然后把结果相除计算出其比值为相对表达量。

1.6 随访 自确诊之日对所有患者开始进行电话随访或门诊复查，1年内每3个月复查1次，2年内半年复查1次，以后至少每年复查一次。2021年1月31日为随访截止日期，共计随访36个月。随访记录患者复发情况、生存时间及随访时状态（存活、死亡或其他）等。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件分析所有数据，对于满足正态分布且组间方差齐的计量资料均采用（±s）表示，两组间差异采用t检验分析，三组间差异采用单因素方差分析，计数资料用率表示，采用χ2检验分析表达水平及其与临床病理特征之间的关系，采用Pearson检验分析p53、ToPo-Ⅱ、GST-π相关性，采用Kaplan-Meier法进行生存率的比较，组间比较采用Log-rankχ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者外周血p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达 经Western blot检测结果显示，NSCLC患者化疗后外周血中的p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白相对表达量均低于化疗前（P＜0.05），见图1。

图1 NSCLC患者外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π表达

2.2 化疗前p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达与临床病理特征的关系 化疗前，NSCLC患者外周血中p53蛋白表达水平与肿瘤直径、临床分期及分化程度相关（P＜0.05）；ToPo-Ⅱ蛋白表达水平与肿瘤直径、临床分期、分化程度以及是否合并淋巴结转移相关（P＜0.05）；GST-π蛋白表达水平与临床分期、分化程度以及是否合并淋巴结转移相关（P＜0.05），见表1。

表1 外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达与临床病理特征的关系（±s）

表1 外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达与临床病理特征的关系（±s）

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2.3 化疗后p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达与NSCLC患者预后的关系 随访3年，109例NSCLC患者中有12例失访，剩下的97例NSCLC患者。采用中位数法，将患者分为p53、ToPo-Ⅱ、GST-π高表达组49例，低表达组48例。p53低表达患者3年总生存率为29.63%，中位生存期为29.76个月，显著高于ToPo-Ⅱ高表达患者（18.57%，23.81个月），差异具有统计学意义（Log-rankχ2=4.467，P=0.034）。ToPo-Ⅱ低表达患者3年总生存率为31.67%，中位生存期为29.35个月，显著高于ToPo-Ⅱ高表达患者（18.36%，22.28个月），差异具有统计学意义（Log-rankχ2=4.265，P=0.038）。GSTπ低表达患者3年总生存率为30.16%，中位生存期为30.26个月，显著高于GST-π高表达患者（20.41%，24.25个月），差异具有统计学意义（Logrankχ2=4.661，P=0.031），见图2。

图2 p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达与NSCLC患者预后分析

2.4 p53与ToPo-Ⅱ、GST-π相关性 NSCLC患者外周血中p53与ToPo-Ⅱ蛋白表达水平呈正相关（r=0.221，P=0.027）；p53与GST-π蛋白表达水平也呈正相关（r=0.215，P=0.031）。

3 讨论

NSCLC是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，且其发生、发展过程极为复杂[8]。已有研究显示，NSCLC发病过程与患者的体液、细胞或组织中存在的多种激素、蛋白质、癌基因产物及转录因子有关，这些因素对肿瘤的诊断、临床预后评估等具有重要价值[9]。目前，治疗NSCLC的主要手段是化疗,但肿瘤细胞易对化疗药物产生耐药性导致化疗效果不理想[10]。有文献报道，在介导肿瘤细胞产生耐药性的诸多基因及蛋白中，p53、TopoⅡ和GSTπ的表达发挥了主要的重要[11]。本研究中，NSCLC患者化疗前外周血中p53、TopoⅡ、GST-π表达水平明显高于化疗后。p53抗体编码的p53蛋白是一种抑癌基因，可以调节细胞周期，延缓甚至预防肿瘤细胞的癌变。p53蛋白在许多肿瘤疾病中都会发生突变。一旦发生突变，它的抑癌功能就会丧失，从而加速癌细胞的增殖，促进癌变[12]。TopoⅡ是机体一种重要的核内酶，主要位于正常细胞的S、G、M期，参与DNA复制、转录、重组、分离等过程，并可在G2/M期达至峰值[13]。TopoⅡ不仅可以作为细胞的增殖指数，还可以作为抗癌药物的靶点，其作用机制为TopoⅡ通过与化疗药物结合而造成DNA复制和转录异常，TopoⅡ表达水平越高，化疗药物具备的靶点越多，对抗癌药物敏感性越高[14]。GST-π属于多基因家族酶类，目前发现有5种同工酶分别为α、μ、π、θ和膜结合型，并与机体解毒作用有关,在许多耐药细胞系中呈高水平表达[15-16]。分析原因，可能由于p53、TopoⅡ、GST-π在肿瘤细胞中活性更高，且对癌细胞增殖的抑制作用减弱，进一步促进癌细胞的增长，并共同参与了NSCLC的多药耐药，提示可通过抑制p53、TopoⅡ、GST-π活性阻止肿瘤细胞的生长。

本研究结果显示，NSCLC患者化疗前外周血中p53蛋白、ToPo-Ⅱ蛋白和GST-π蛋白表达水平与临床分期、分化程度以及是否合并淋巴结转移等有关。这可能是由于p53、TopoⅡ、GST-π可能通过促进癌细胞的侵袭和迁移，影响患者的淋巴结转移情况及临床分期等临床病理特征。本研究结果还显示，NSCLC患者外周血中p53与ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表达水平均呈正相关。既往研究显示，胃癌中TopoⅡ、GST-π与p53蛋白表达具有正相关性[17]。分析原因，可能由于p53基因可能参与诱导ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白的高表达，三者共同介导NSCLC的多药耐药机制。提示p53、ToPo-Ⅱ和GST-π可能共同参与了肿瘤耐药过程，并在肿瘤细胞耐药机制中可能存在相互影响，但其具体作用机制有待进一步研究。本研究通过Kaplan-Meier生存分析结果显示，p53、ToPo-Ⅱ及GST-π高表达组患者平均生存时间明显低于低表达组。这说明p53、ToPo-Ⅱ及GST-π在NSCLC的侵袭转移过程中发挥一定作用，p53、ToPo-Ⅱ及GST-π高表达均可提示NSCLC预后不良。

综上所述，NSCLC外周血中p53、TopoⅡ、GST-π表达水平明显上调，与患者临床病理有一定关系，且高表达患者生存率较低。