外周血CD34+细胞对骨髓增生异常综合征分型及预后意义分析

肖德俊，刘志晴，肖作淼，叶萍，刘聪，钟明星

（1.江西赣州市人民医院检验科，江西 赣州 341000；2.江西赣州市人民医院手术室，江西 赣州 341000；3.江西赣州市人民医院血液科，江西 赣州 341000）

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组造血干/祖细胞恶性克隆性疾病，骨髓表现为造血细胞发育异常或原始细胞增多，外周血表现为血细胞减少或原始细胞增多。根据2012年MDS国际预后积分IPSS-R，MDS的预后与外周血中性粒细胞计数，血小板计数，血红蛋白含量，骨髓原始细胞数量以及核型有关。有文献报道，外周血中的CD34+细胞与MDS的预后也具有一定的相关性。本研究搜集了2018-2019年我院按照2016版WHO标准确诊的MDS患者资料，对外周血CD34+细胞百分比与绝对值计数与MDS患者预后及分型的意义的进行了统计学分析。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集赣州市人民医院血液科2018年03月至2019年09月根据2016版WHO的MICM综合诊断标准确诊的骨髓增生异常综合征患者51例。其中36位男性，15位女性患者。平均年龄为62.6岁（40～72岁），对照组选取同年龄段的健康体检患者20例。

1.2 仪器与试剂 仪器为BD FACSCanto II流式细胞仪(美国BD公司产品)，分析软件为BD FACSCantoTMII。鞘液为BD FACSFlowTM。试剂盒为BDTMStem Cell Enumeration(SCE)试剂盒，包括BD Stem Cell试剂(CD45/CD34)：处于含有BSA和0.1%叠氮化钠的PBS中，试剂盒包含CD45 FITC,clone 2D1和CD34 PE,clone 8G12.7-AAD试剂：一种核酸染料，用于鉴别死细胞10X氯化铵裂解液：该裂解液不含固定剂，用于红细胞裂解。BD Trucount管：每一个管中包含一粒冻干的荧光微球。

1.3 检测方法

1.3.1 抽取患者治疗前和健康对照者静脉血2 ml，EDTA管抗凝。取TruCOUNT管2支，管中含有定量的荧光微球，分别标记为(测定管)和对照管)。⑴往管底加入20μl的BD Stem Cell试剂。注意不要碰到微球。⑵往管中加入20μl 7-AAD试剂。⑶使用反向加样法，往管中加入100μl充分混匀的样本，轻微涡旋 混匀。室温避光孵育20 min(20～25°C)。⑷每管中加入2 ml 1X氯化铵裂解液，轻微涡旋混匀。室温避光孵育10 min(20～25°C)。⑸立即将样品置于湿冰上上机检测，分析并报告结果，计算外周血循环CD34+细胞占有核细胞的百分比和绝对值。

1.3.2 IPSS-R预后积分系统 细胞遗传学，骨髓原始细胞百分比，血红蛋白，血小板，中性粒细胞计数进行积分，≤1.5分为极低危，＞1.5-3分为低危，＞3-4.5分为中危，＞4.5-6分为高危，＞6分为极高危。

表1 MDS分型:标准

表2 IPSS-R预后积分系统

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件处理数据，IPSS-R分组和健康人的比较采用One-Way ANOVA中的Welch法和Brown-Forsythe法检验进行统计学分析，组与组之间的多重比较采用Dunnett T3和Dunnett C进行统计学分析。SLD/MLD组和EB-1/EB-2组之间的比较采用独立样本的T检验。

2 结果

CD34+细胞在骨髓增生异常综合征患者和健康人中的表达，见表3。

表3 外周血CD34+细胞在MDS和健康人中的表达情况

2.1 CD34+细胞在2016版WHO分型中的表达CD34+细胞百分比、绝对值在SLD/MLD分型组中的表达均低于EB-1/EB-2分型组，且百分比的差异绝对统计学意义（P＜0.05），绝对值的差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 CD34+细胞在骨髓增生异常综合征IPSS-R预后危险度分组和健康人群中的表达 CD34+细胞在健康人群、IPSS-R极低危、低危、中危、高危、极高危组中的表达逐渐增高，且具有统计学差异（P＜0.05），其中极低危与低危组的差异无统计学意义（P＞0.05），高危组与极高危组的差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

CD34抗原是唾液酸黏蛋白的I型跨膜磷酸糖蛋白，是未成熟的造血前体细胞和造血集落细胞的一个特异性标记抗原，随着细胞的成熟逐渐减弱或消失。正常生理情况下，外周血中CD34+细胞极为罕见，百分比约为0.006～0.045%，绝对计数为0.32～3.50个/μl[1]。在一些病理情况下，外周血CD34+细胞的数量会增多，比如急慢性白细胞，骨髓增生异常综合征等疾病[2]。有学者研究了低增生的MDS-RCMD患者和AA疾病组、正常对照组中CD34+细胞表达的差异，发现MDS-RCMD组CD34+细胞的表达要高于AA组和正常组，且有统计学差异[3-4]，并发现CD34+细胞＞0.5%作为可以作为一个临界鉴别指标[5]。在本组研究中发现，CD34+细胞＞0.5%是IPSS-R预后危险度中、高危组与低危组的一个分界指标，同样在分型中也是SLD/MLD与原始细胞增多组EB-1/EB-2的一个分界指标。骨髓增生异常综合征患者外周血循环CD34+细胞百分比及绝对数不仅高于健康对照者[4]，并且随着病情的进展持续升高[6]。有学者认为CD34+细胞可以作为骨髓增生异常综合征患者IPSS-R中的一个独立危险因素，且将CD34+细胞百分比＞1%可以作为骨髓增生异常综合征转化为白血病的一个危险信号[7-9]且与低危型MDS患者的与不良预后有关[10]，其中的机制可能与CD34+细胞自噬活性的减低[11]，Shh信号通路的激活[12]、Gli1基因的表达[13]以及IGF-IR[14]有关。

本研究同时检测了骨髓增生异常综合征患者和健康人群外周血CD34+细胞百分比和绝对值，Cesana C等认为CD34绝对值计数比CD34百分比对骨髓增生异常综合征预后判断更为敏感[15]，本研究发现，CD34绝对值计数与CD34百分比与骨髓增生异常综合征的分型和预后相关，且CD34绝对值计数比CD34百分比在骨髓增生异常综合征分型中更为敏感，但在IPSS-R预后危险度分组中，二者都是随着危险度的升高逐渐增加，没有体现出敏感性的差异，后期可加大样本量继续研究CD34绝对值与百分比对骨髓增生异常综合征预后的差异性。

2016版WHO中骨髓增生异常综合征的分型主要依靠形态学计数，但形态学主观性较强，且手工计数细胞数量较少。流式细胞CD34+细胞计数克服了这一不足，邢江涛等做了316例MDS患者CD34抗原表达和，形态学计数的比较，发现符合率达到了77.21%并且无统计学差异[16]，建议可将CD34+细胞作为骨髓增生异常综合征WHO分型、IPSS-R危险度分层及预后判断的一个重要指标。