dCTP焦磷酸酶在乳腺癌组织中的表达情况及临床意义研究

王铭，李坤，李春景

（濮阳市第五人民医院，河南 濮阳 457000）

乳腺癌作为威胁女性健康的常见疾病正受到医学界的密切关注。研究显示[1-2]，不同地区患者预后差异较大，这可能与医疗基础设施水平等因素有关，对于发达国家而言，通过早期筛查、及时医治能大大降低乳腺癌的病死率，患者的5年生存率也较高。当下，我国对于乳腺癌的早期鉴别诊断及医疗措施手段方面均有所欠缺,探寻行之有效的乳腺癌诊疗标志物是目前临床丞待解决的关键问题。文献报道[3-5]，dCTP焦磷酸酶（dCTPPyrophosphatase 1，DCTPP1）在前列腺癌、胃癌等癌组织中呈现过表达状态，并有证据显示其过表达状态可能与临床分期、淋巴结转移等临床病理因素存在一定关系，更高的DCTPP1表达水平可能预示着患者有更高的疾病复发率及更短的生存时间。尽管已有少数国外学者报道DCTPPl在乳腺癌组织中的表达水平及与临床特征的关系，但国内针对该部分领域的研究仍处于起步阶段。基于此，本研究创新性地尝试对比DCTPPl在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，并探讨癌组织中DCTPPl表达水平与各类临床病理特点及患者预后的关系，初步探究DCTPPl在表达在乳腺癌发生、发展中的潜在意义，为今后临床探寻新的乳腺癌诊疗靶点提供资料依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年6月至2017年12月在本院行手术治疗乳腺癌的女性患者82例，每例标本均取癌组织为癌组织组，取距癌边缘5 cm以上的正常组织为癌旁组织组。其中，年龄38～68岁，平均（53.19±7.32）岁；肿瘤分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级46例，Ⅲ级31例；淋巴结转移52例，淋巴结无转移30例；非浸润性癌8例，浸润性癌74例。经患者及家属的知情同意并签署知情同意书，本研究经本院道德伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：⑴均经病理检查证实为乳腺癌；⑵蜡块保存完好，病例及随访资料完整；⑶手术前无免疫治疗或放、化疗史。

排除标准：⑴伴其他原发性肿瘤；⑵所需资料缺失；⑶伴重要脏器严重功能障碍；⑷伴精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 资料收集 收集患者的临床资料，包括年龄、肿瘤分级、T分期、淋巴结转移情况、组织类型、雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）、孕激素受体（Progesterone Receptor，PR）、人类表皮生长因子受体2 （human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2）表达情况。通过电话、门诊复查等方式，随访患者自治疗后3年内疾病复发或死亡情况。

1.3.2 组织标本处理 使用氯化钠溶液将标本进行冲洗后以10%的中性福尔马林固定，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，使用RM2335型切片机（德国莱卡公司）对石蜡标本进行切片，厚度4μm。

1.3.3 免疫组化染色检测DCTPPl表达水平 将石蜡切片放入恒温箱中进行烘烤（温度65℃，时间30 min），随后依次使用梯度浓度的二甲苯和酒精来进行脱蜡、水化。室温下使用自来水、蒸馏水依次冲洗各2 min后将切片放入3%H2O2的PBS溶液中，浸泡约10 min，PBS反复冲洗3次后使用抗原修复液进行修复。修复结束后再次使用PBS反复漂洗、浸泡3次，加入山羊血清，室温封闭10 min。将切片表面多余的山羊血清甩去，向其滴加50～100μl的DCTPPl抗体（浓度1：300，购自英国Abcam公司），4℃孵育过夜（注：阴性对照中用PBS替代一抗）。PBS反复冲洗3次，向其滴加Streptavidin-HRP工作液（浓度1：200，购自北京中杉金桥生物技术有限公司），再次放入恒温箱中进行孵育（温度37℃，时间60 min）。PBS反复冲洗3次后，向其滴加DAB（购自美国Sigma-Aldrich公司）显色3～5 min，苏木素复染2～3 min，再以0.1%盐酸进行分化后应用自来水冲洗，二甲苯透明，最后中性树脂封片。

评分标准：由2位5年以上相关经验的资病理科医师对切片结果来进行双盲评分，在光学显微镜下随机选取5个视野（400倍），阳性染色细胞定义为细胞核或（和）细胞质显示为棕黄色。采用来DCTPP1阳性细胞比例对染色强度进行评分：+（＜25%），++（25%～49%），+++（50%～74%），++++（≥75%）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析数据，计数资料以%表示，采用χ2检验；计量资料以±s表示，2组间比较采用两样本独立t检验，3组间比较采用单因素方差分析；采用Spearman相关性分析乳腺癌患者DCTPP1表达水平与临床病理因素及预后的相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组DCTPP1表达水平比较 癌组织细胞核DCTPP1评分较癌旁组织明显升高（P＜0.05），但二者细胞质DCTPP1评分比较差异不明显（P＞0.05）。见表1。

表1 2组DCTPP1表达水平比较（±s）

表1 2组DCTPP1表达水平比较（±s）

注：与细胞核相比，a P＜0.05。

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2.2 核DCTPP1表达水平与临床病理特征的关系不同年龄、组织类型及ER、PR、HER-2表达情况的乳腺癌患者，其核DCTPP1表达水平差异不明显（P＞0.05），但不同肿瘤分级、T分期及淋巴结转移情况的乳腺癌患者，其核DCTPP1表达水平差异显著（P＜0.05）。见表2。

表2 核DCTPP1表达水平与临床病理特征的关系（±s）

表2 核DCTPP1表达水平与临床病理特征的关系（±s）

注：与肿瘤分级中Ⅰ级比，a P＜0.05；与T分期中T1期比，b P＜0.05。

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2.3不同预后患者癌组织DCTPP1表达水平比较预后不良组细胞核DCTPP1评分较预后良好组明显升高（P＜0.05），但二者DCTPP1细胞质DCTPP1评分率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同预后患者癌组织DCTPP1表达水平比较（±s）

表3 不同预后患者癌组织DCTPP1表达水平比较（±s）

注：注：与细胞核相比，a P＜0.05；b预后不良定义为3年内疾病复发或患者死亡。

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2.4 核DCTPP1表达水平与临床病理因素及预后的相关性 采用Spearman相关性分析乳腺癌患者DCTPP1表达水平与临床病理因素及预后的相关性（变量赋值：肿瘤分级，Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3；T分期，T1=1，T2=2，T3=3；淋巴结转移：无转移=0，有转移=1；预后，预后良好=0，预后不良=1），结果显示，乳腺癌患者核DCTPP1表达水平与肿瘤分级、T分期、淋巴结转移及预后呈显著正相关关系（P＜0.05）。见表4。

表4 癌组织核DCTPP1表达水平与临床病理因素及预后的相关性

3 讨论

核苷三磷酸焦磷酸酶(nucleotide triphosphates pyrophosphatase，NTP-PPase)是一种能水解核苷三磷酸（nucleotide triphosphates，NTPs）的酶，水解产物包括焦磷酸和核苷单磷酸，其能够将肿瘤细胞中的非正常核苷酸进行水解，从而维持机体核苷酸池内常见NTPs的平衡状态，并及时清扫具有细胞毒性的代谢产物，以此来减少非正常核苷酸的掺入水平，降低突变风险，从而发挥保障DNA准确复制的效用，承担“守门员”的作用[6]。DCTPP1属于NTP-PPase蛋白超家族一员，表达于人类细胞，被发现与多种肿瘤组织学亚型、TNM分期及淋巴结转移情况等有一定相关性[7-9]。

目前国内针对DCTPP1在乳腺癌组织中的表达研究较少，仅有少数学者对比了乳腺癌癌组织与癌旁组织中DCTPP1阳性表达率的区别，而并未深入探讨DCTPP1在肿瘤细胞核和细胞质中的表达差异[10]。本组收集了82例乳腺癌患者的肿瘤组织及癌旁组织，检测了2种组织中DCTPP1表达情况，结果显示，2种组织间细胞核DCTPP1评分差异显著，在乳腺癌患者标本中在癌旁组织的细胞核DCTPP1评分显著低于肿瘤区域；同时，乳腺癌肿瘤细胞的细胞核、细胞质均检测到DCTPP1蛋白表达，癌组织中DCTPP1的细胞核阳性表达率较细胞质更高，提示癌细胞中存在DCTPP1的核累积现象。我们推测上述现象出现的原因可能与DCTPP1在乳腺癌的发生、发展中参与了一定的调控机制有关。对于维持人体细胞正常工作而言，准确地进行DNA复制十分重要，而一旦机体遭遇病原体感染、氧化损伤等生理病理过程时，容易出现非正常核苷酸，而后增大DNA损伤及诱变的风险[11-13]。为了保持基因组的完整和稳定型，NTP-PPase酶修复系统发挥了关键的预防机制作用，DCTPP1会参与调节代谢非正常核苷酸，在癌组织核DNA中DCTPP1会被不断动员，从而清除非正常核苷酸，维持细胞核苷酸库高纯度，因而表现出DCTPP1在癌细胞中的细胞核累积，以保证肿瘤细胞有丝分裂期间能够合成正确的DNA。

本研究进一步探讨了核DCTPP1表达情况与乳腺癌病理特征间的关系，结果表明，不同年龄、组织类型及ER、PR、HER-2表达情况的乳腺癌患者，其核DCTPP1表达水平差异不明显，但不同肿瘤分级、T分期及淋巴结转移情况的乳腺癌患者，其核DCTPP1表达水平差异显著，与李辉等[10]的研究结论类似。Spearman相关性分析结果显示，乳腺癌患者癌组织核DCTPP1表达水平与肿瘤分级、T分期、淋巴结转移呈显著正相关关系，证实了核DCTPP1表达水平与乳腺癌肿瘤各病理特征关系密切。研究表明[14-16]，炎症反应在肿瘤的启动、诱发等多个阶段都有关键作用，炎症细胞因子的大量分泌会使癌前细胞的活性氧浓度增大，可能会造成DNA损伤等，使其发生表观遗传学层面的变化，进而促进肿瘤的生成。我们推测在肿瘤分级更高、T分期更后及发生了淋巴结转移的乳腺癌患者中，其乳腺癌出现部位的DNA损伤程度可能较重，因而核苷酸池中非正常核苷酸的占比较高，此时机体的预防机制发挥重要作用，为降低突变风险，维持核苷酸池的平衡状态，机体会显著上调DCTPPl蛋白表达，因而我们观察到此类患者的癌组织细胞中DCTPPl表达水平出现进一步提升。此外，本研究观察到预后不良患者的核DCTPPl表达水平显著高于预后良好患者，且核DCTPPl表达水平与患者预后正相关关系，提示通过检测核DCTPPl表达水平可能对乳腺癌患者预后情况有潜在的预测价值。一般而言，肿瘤分级较低、T分期靠前及无淋巴结转移情况的乳腺癌肿瘤患者接受治疗后预后较好，DCTPPl表达水平较高的患者其肿瘤进展的程度往往较高、病灶较大，因此患者预后情况出现相对不理想的概率更大。

综上所述，DCTPPl在乳腺癌组织肿瘤细胞核中表达水平明显上升，其与肿瘤分级、T分期、淋巴结转移及预后存在正相关关系，在乳腺癌的发生、发展中可能扮演关键角色，对乳腺癌患者预后有潜在的预测价值。