QuEChERS净化—气相色谱—质谱法测定食用植物油中4种合成抗氧化剂

郑鸿涛 刘子雄 魏 荣 谢国丹 董 海 谭贵良

(1. 中山市食品药品检验所，广东 中山 528437；2. 电子科技大学中山学院，广东 中山 528402)

油脂是人体必不可少的一种重要营养素。食用植物油经精炼加工后，天然存在的抗氧化成分(如维生素E)会大量损失[1-2]；在贮藏、使用过程中，也极易与空气中的氧气发生氧化反应，引起油脂酸败变质，从而产生对人体有毒有害物质。油脂氧化是造成油脂变质的主因，目前常用的阻止氧化反应发生的方法是向油脂中添加抗氧化剂[3-4]，其中，合成抗氧化剂有2，6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、2，6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)(其结构式见图1)等。动物试验[5-7]表明，高剂量的苯酚类抗氧化剂会造成细胞凋亡、DNA裂解等潜在健康危害，随着食品毒理学方法的发展，目前被认为无害的食品添加剂可能存在慢性毒性和致畸、致突变、致癌性的危害。因此，国家卫计委在GB 2760—2014中对抗氧化剂在食用植物油中的最大使用量作出了严格的限定。

GB 5009.32—2016《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》是检验检测机构现行采用的抗氧化剂的国标检测方法。该标准的前处理净化过程主要依赖于凝胶渗透色谱(GPC)，其操作繁琐，有机溶剂消耗多，对环境污染大，一次性处理样品量较少，无法实现高通量处理，而且GPC在各实验室中的应用尚未普及。文献[8-10]采用高效液相色谱(HPLC)法检测食用油脂中的多种抗氧化剂，但其中涉及的前处理方法多采用液液分配直接进样，其过程需接触大量有机溶剂；柱层析或固相萃取(SPE)净化，需先对样品进行萃取和浓缩，再通过柱层析净化，耗时较长。QuEChERS是一种快速、简单、低成本的样品前处理技术[11]。该技术很好地解决了传统前处理方法操作繁琐、环境污染大等问题，已被广泛应用于食品中农药残留[12-13]和真菌毒素检测[14-15]等方面，但应用在同时测定花生油等多种油脂基质中抗氧化剂的报道尚未见。景赞等[16]采用QuEChERS-气相色谱—串联质谱质法(GC-MS/MS)检测了花椒油中3种抗氧化剂(BHA、BHT、TBHQ)，结果表明样品经QuEChERS净化后可有效去除干扰物质，基质效应较小，但该方法中的串联质谱仪(MS/MS)设备昂贵，且检测对象单一。研究拟采用QuEChERS前处理技术结合气相色谱—质谱联用(GC/MS)法开发一种快速检测七大类食用植物油(花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油和调和油)中4种合成抗氧化剂的方法，并对市售的21批次食用植物油进行检测，旨在为相关市场监管部门对此类产品的监管提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、调和油7类食用植物油：市售；

乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管(5982-1010)、EMR-Lipid polish反萃取管(5982-0101)：美国安捷伦科技有限公司；

图1 4种合成抗氧化剂的结构式Figure 1 Structural formula of 4 synthetic antioxidants

2，6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)标准品：纯度98.8%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基对羟基茴香醚(BHA)标准品：纯度99.8%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基对苯二酚(TBHQ)标准品：纯度97.7%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

2，6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)标准品：纯度99.1%，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱—质谱联用仪：7890B/5977A型，配EI离子源，美国安捷伦科技有限公司；

冷冻离心机：3-18K型，德国Sigma公司；

数显型涡旋混匀器：MS 3 digital型，德国IKA公司；

超声仪：SCQ-7201E型，上海声彦超声波仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

(1) 样品提取：称取1 g(精确至 0.001 g)食用植物油于50 mL离心管中，加入10 mL正己烷饱和的乙腈(或甲醇、无水乙醇、乙腈)，3 000 r/min涡旋震荡2 min，超声提取15 min，于3～8 ℃、10 000 r/min离心3 min，取上层液备用。

(2) 样品净化：移取5 mL上层液于EMR-Lipid dSPE净化管(净化管需先用1 mL纯水活化)，3 000 r/min涡旋震荡2 min，冷冻离心。

(3) 样品反萃取：取净化离心后的上层液(阴性样液)3～4 mL分别加入到5982-0101、5982-0102两种反萃取管中，3 000 r/min涡旋震荡2 min，冷冻离心，上层液过0.22 μm 尼龙滤膜，收集滤液于样品瓶中供GC/MS分析，考察不同组合QuEChERS对阴性样品的净化效果。

1.2.2 仪器分析条件

(1) 色谱条件：DB-35MS毛细管色谱柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；不分流进样；进样量1 μL；柱流速1.0 mL/min；载气为高纯氦气(≥99.999%)；程序升温：90 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至140 ℃，保持9 min，以30 ℃/min升温至280 ℃，保持3 min。

(2) 质谱条件：MSD传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离方式为EI；电子轰击能量70 eV；溶剂延迟6 min；扫描方式为全扫描m/z50～550，扫描速率3.125 amu/s；数据采集类型为SIM，选择离子峰面积外标法进行测定。

1.2.3 基质效应评价 参照苏萌等[17-18]的方法。用乙腈溶剂配制标液将花生油等7种空白食用植物油基质在线性范围内配制成低、中、高不同浓度的基质标液进行测试，评价4种合成抗氧化剂在各种食用植物油中产生的基质效应。

1.2.4 线性方程、检出限与定量限测定 取7种食用植物油阴性样品，采用基质加标曲线外标法定量，按1.2.1的方法进行前处理，制备0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的基质混合标准工作溶液，上机测定，以标准溶液浓度为横坐标、响应值为纵坐标绘制校准曲线。以定量离子信噪比为3(S/N=3)和10(S/N=10)时的响应定义4种抗氧化剂的方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.2.5 准确度与精密度测定 采用菜籽油等7种不同类型空白食用植物油基质，通过加标测试计算各抗氧化剂在不同食用植物油中的回收率，以此验证方法的准确度；以5 μg低浓度添加水平在不同食用植物油基质中进行测试，计算各抗氧化剂在不同食用植物油基质中6次平行测试结果的相对标准偏差，以此验证方法的准确度。

1.2.6 实际样品验证 用试验建立的方法对市售的花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、调和油七大类食用植物油共21批次进行上机检测，验证试验方法的准确性。

1.2.7 数据处理 使用安捷伦MSD ChemStation、Mass Hunter Workstatiom Software工作站软件对研究的4种合成抗氧化剂的定量离子进行数据处理，峰面积外标法定量，保留时间和定性离子进行定性；用Excel软件对样品含量、精密度、回收率数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理过程优化

试验的4种合成抗氧化剂均为极性物质，极易溶于油脂及有机溶剂，如甲醇、无水乙醇、乙腈等。选用甲醇、无水乙醇、乙腈3种溶剂作为萃取剂，以加标回收方式进行比较，均获得了不错的提取效果，但萃取净化后甲醇萃取管壁上仍有挂壁油状残留物，说明乙醇和乙腈作为食用油中抗氧化剂的萃取剂其效果优于甲醇，但由于乙醇极易挥发，不适合批量样品的检测，最终选择不易挥发的乙腈作为研究抗氧化剂的萃取剂。参照GB 5009.32—2016以及Chattetjee等[19-20]的方法，由于正己烷和乙腈具有一定的互溶性，萃取前先将乙腈用正己烷进行饱和处理，经正己烷饱和的乙腈提取样品中抗氧化剂时，可以减少萃取样品中油脂等非极性的组分，从而达到更好的去脂效果，为后续EMR-Lipid dSPE净化处理减负。由图2 可知，5982-0101反萃取管的净化效果较5982-0102反萃取管的更为显著，因此采用5982-0101反萃取管进一步除脂净化。

2.2 基质效应评价

当基质效应为80%～120%时，基质效应较弱，可忽略；当基质效应<80%或>120%时，存在很强的基质抑制或增强效应，需用基质匹配曲线进行校正。由图3可知，4种合成抗氧化剂在各食用植物油中的基质效应(增强或抑制)基本一致；各抗氧化剂浓度的变化对基质效应的影响不显著；BHT、TBHQ、Ionox-100存在较强的基质增强效应，BHA的基质效应并不明显。为了尽可能地降低基质效应的干扰，采用空白基质配制标准曲线对目标物进行定量分析。

图2 经两种不同反萃取管净化后的食用植物油总离子流色谱图Figure 2 Chromatogram of total ion flow of edible vegetable oil purified by two different reverse extraction tubes

图3 4种合成抗氧化剂的基质效应评价Figure 3 Matrix effect evaluation of 4 synthetic antioxidants

2.3 色谱条件优化

分别选用HP-1MS、HP-5MS、DB-35MS 3种毛细管色谱柱(柱长均为30 m)进行试验，结果表明，3种色谱柱均能分离出4种抗氧化剂，但HP-1MS、HP-5MS毛细管色谱柱的响应值较DB-35MS的低，且分离TBHQ时峰拖尾现象较为严重，影响低浓度目标物的分析；采用DB-35MS分析4种抗氧化剂时，其响应值、分离度和峰对称性均较好，因此选用DB-35MS毛细管色谱柱进行分析，并对色谱分离条件进行优化，测试分析得到4种合成抗氧化剂的标准离子流色谱图如图4所示。由图4可知，DB-35MS毛细管色谱柱在17 min内能有效分离4种合成抗氧化剂，其分离度好、分析时间短且能够满足方法要求。

2.4 质谱条件优化

根据质谱图上各碎片离子的响应丰度，选择3～5个丰度较高、质荷较大的离子进行SIM检测以保证检测结果的灵敏度和准确性。图5为BHT、BHA、TBHQ、Ionox-100 4种合成抗氧化剂全扫描得到的离子碎片图，由图5可知，离子205.1、165.1、166.1、221.1具有较高的响应丰度和较大的质荷比，可作为定量离子，220.2、206.2、180.1、137.0、123.0、151.1、236.1、222.2响应丰度也较高，可作为定性离子；驻留时间的设定要确保每个目标峰轮廓光滑，峰面积稳定，最终确定如表1的质谱参数为研究试验的质谱参数。

图4 4种合成抗氧化剂选择离子TIC叠加图Figure 4 Stack of four synthetic antioxidants selected by ion TIC

图5 4种合成抗氧化剂离子碎片图Figure 5 Four synthetic antioxidant ion fragments

表1 4种合成抗氧化剂的质谱参数表

2.5 线性方程、检出限与定量限

由表2可知，4种合成抗氧化剂在0.5～20.0 μg/mL内呈良好的线性关系，相关系数R2均>0.999；4种抗氧化剂的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg，符合分析技术要求。

2.6 准确度与精密度

由表3可知，4种合成抗氧化剂在低、中、高各添加水平的加标回收率为84.1%～108.0%。由表4可知，各种食用植物油的相对标准偏差RSD为0.4%～4.5%，说明试验方法具有较高的准确度和精密度。

表2 4种合成抗氧化剂的检出限、定量限、线性范围及相关系数

表3 4种合成抗氧化剂在不同食用植物油基质中的加标回收率

表4 4种合成抗氧化剂在不同食用植物油基质中的精密度

2.7 实际样品分析

实际样品检测发现，BHT和BHA各检出1批次，TBHQ检出9批次，其含量为50～120 mg/kg，低于GB 2760—2014允许的最大添加量200 mg/kg，说明中国食用植物油所添加的抗氧化剂中，毒性偏强的BHA、BHT、Ionox-100正逐渐被毒性较小的TBHQ所替代。同时对购自广州谱恩科学仪器有限公司的食用油质控样品进行了验证，并与GB 5009.32—2016中涉及的凝胶渗透色谱(GPC)-GC/MS方法进行了比较，其结果见表5。由表5可知，试验开发的方法与GPC-GC/MS的检测结果均落在质控样品测试结果满意区间内，且无明显差异，表明开发的检测方法获得的检测数据准确可靠，且新方法的工作效率较国标法有明显的提升。

表5 采用不同方法得到的质控样品分析结果

3 结论

研究结果表明，运用QuEChERS前处理技术对食用植物油基质进行提取和净化，可以很好地解决脂质去除和分析物回收之间两难的问题，所建方法与采用固相萃取、凝胶渗透色谱净化效果相同；且可以实现高通量处理，其工作效率更高；此外研究对各类食用油脂中的抗氧化剂进行了检测方法分析，其检测类别广、覆盖面全。研究方法的自动化程度高，操作简单、有机溶剂使用量少、对环境友好、油脂去除效果显著、灵敏度、精密度及回收率均可满足国内外相关标准对食用植物油中抗氧化剂的限量要求。在QuEChERS样品前处理过程中，试验仅对商品化的EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管、EMR-Lipid polish反萃取管进行研究，未对其内在各成分展开深入探讨，后续可通过改良QuEChERS组合中的成分寻求更佳试验方案。