羊肝蛋白稳定性及NaCl质量分数对其功能特性的影响

张晓燕 吴子健 陆健康 侯惠静 柳昊杰 孟令莉 赵颖涛

(1. 天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2. 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843399；3. 天津天狮学院食品工程学院，天津 301700；4. 天津商业大学艺术学院，天津 300134)

肝脏是肉制品加工后廉价的副产物，含有大量的蛋白质和丰富的营养元素，如：氨基酸、矿物质和脂肪酸等[1-2]。由于缺乏对羊肝蛋白质功能特性的研究，使得其利用局限于肝酱制品和动物饲料。与鸡肝和猪肝相比，羊肝中不仅含有丰富的微量元素(如Cu、Fe)和必需脂肪酸(如γ-亚麻酸)，而且含有大量维生素和蛋白质(17.90 g/100 g·羊肝)[3-4]，使得其具有抗氧化、抑制脂质过氧化、抗肿瘤以及提高机体免疫力等功能[5]。目前有关羊肝的研究基本集中在产品开发和工艺优化等方面，例如：韩志慧等[6]将利用发酵和脱膻法去除了膻味羊肝与具有明目功效的营养液混合，研制得到了新型的羊肝羹；李黎等[7]研制和开发了具有明目功效的羊肝口服液，并对其工艺参数进行优化；张宇[8]优化了羊肝蛋白的提取工艺，并考察其抗氧化活性；文飞[9]优化了羊肝蛋白多肽的制备工艺，并考察其抗氧化活性，未见NaCl含量对羊肝中不同蛋白组分功能特性影响的报道。

试验拟研究羊肝蛋白的稳定性及NaCl含量对水溶性羊肝蛋白(Water soluble liver proteins，WSLP)和盐溶性羊肝蛋白(Salt soluble liver proteins，SSLP)的乳化性、起泡性，以及其分子量分布和表面疏水性，以期为羊肝蛋白的加工利用提供数据支持与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料前处理

选取新鲜美利奴羊羊肝，手工除去血管和脂肪组织，然后分割成300 g左右的组织块，真空包装后，贮存于-40 ℃ 下直至分析。

1.2 试剂

磷酸氢二钠、氯化钠：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

磷酸二氢钠：分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；

十二烷基硫酸钠：分析纯，天津博迪化工股份有限公司；

三(羟甲基)氨基甲烷：分析纯，上海山浦化工有限公司；

考马斯亮蓝G-250：分析纯，上海蓝季科技发展有限公司。

1.3 仪器与设备

高压均质机：AH100B型，加拿大ATS公司；

纳米粒度分析仪：Zetasizer Nano-ZS 90型，英国Malvern公司；

离心机：3-18K型，德国Sigma公司；

真空冷冻干燥机：日本EYELA公司；

荧光分光光度计：FL970型，香港Techcomp公司；

垂直电泳系统：SE 260型，美国Hoefer公司；

超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N50型，德国IMPLEN公司；

凝胶成像系统：Essential V6型，英国Uvitec公司；

差示扫描量热仪(DSC)：STA 449F3型，耐驰科学仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 羊肝基础指标的测定

(1) 羊肝粗蛋白含量：凯氏定氮法[10]。

(2) 脂肪含量：索氏提取法[11]。

1.4.2 羊肝蛋白提取 取冷冻羊肝4 ℃下过夜放置融化后组织研磨，加入4倍体积的4 ℃的0.05 mol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)，室温下振荡提取30 min后，于4 ℃离心(10 000×g)15 min，收集上清液，沉淀重复上述提取步骤两次，合并3次提取的上清液即为WSLP水溶液；取提取WSLP的沉淀加入4倍体积0.60 mol/L NaCl溶液(0.05 mol/L、pH 7.4的磷酸钠缓冲液)，按上述步骤提取合并上清液即为SSLP溶液；所得WSLP溶液和SSLP溶液置于4 ℃下透析(透析膜的分子截留量为8 000～13 000 kDa) 48 h[12]。

1.4.3 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 参照文献[13]，具体参数：分离胶12%、浓缩胶5%、样品蛋白质量浓度1.5 mg/mL，上样量7 μL，电压200 V、电泳时间40 min左右。

1.4.4 热稳定性 根据李艳青[14]的方法采用差示扫描量热仪(DSC)测定。称取5～8 mg蛋白样品于铝盒中，使用空置铝盒作为空白。设置参数为：测定温度20～150 ℃，加热速度10 ℃/min，采用pyris6.0软件进行数据采集。

1.4.5 蛋白粒径及Zeta电位的测定 采用纳米粒径分析仪测定，设置参数为：蛋白质量浓度1 mg/mL；使用配有He/Ne激光器，λ=633 nm。

1.4.6 表面疏水性的测定 取4.0 mL蛋白溶液(质量浓度范围为0.01～0.05 mg/mL)加入20 μL的8.0 mmol/L ANS试剂，室温下反应1.0 min后测定其荧光吸收值，荧光分光光度计设备参数为：激发波长370 nm、发射波长490 nm、夹缝5 nm、扫描速率60 nm/s。以未加ANS的蛋白溶液为空白，然后以荧光强度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标作图，其斜率即可反映蛋白质的表面疏水性(Ho)[15]。

1.4.7 乳化性(EAI)及乳化稳定性(ESI)的测定 提取的羊肝蛋白溶于NaCl溶液中至蛋白质量浓度为1.0 mg/mL，并以4∶1(V羊肝蛋白盐溶液∶V大豆油)的比例加入大豆油，均质(转速为10 000 r/min)1 min立即从底部取100 μL均质后溶液，并加入10.0 mL十二烷基硫酸钠溶液(0.1%、pH 7.0)，混合均匀，测定500 nm下的吸光度记为A0，10 min 后，重复之前操作，测定吸光度，记为A10。分别按式(1)和式(2)计算乳化性指数(Emulsifying activity index，EAI)、乳化稳定性指数(Emulsifying stability index，ESI)[16-17]。

(1)

(2)

式中：

IEA——乳化性指数，m2/g；

IES——乳化稳定性指数，min；

φ——油相体积分数(油的体积/乳化体系的体积)，25%；

C——样品蛋白质含量，mg/mL；

A0、A10——乳化体系在0，10 min时的吸光度；

N——稀释倍数，100。

1.4.8 起泡性(FA)及泡沫稳定性(FS)的测定 使用NaCl溶液调节蛋白溶液的质量浓度为2.0 mg/mL，记录起始溶液体积为V0，以10 000 r/min均质2 min，测量蛋白溶液和泡沫的总体积，计为V1，30 min后，再次测量蛋白溶液和泡沫的总体积，计为V2。分别按式(3)、(4)计算起泡性(Foaming activity，FA)、泡沫稳定性(Foaming stability，FS)[18]。

(3)

(4)

式中：

AF——起泡性，mL/g；

SF——泡沫稳定性，%；

V0——初始时的液面高度，cm；

V1——均质后的液面高度，cm；

V2——静置30 min后的液面高度，cm。

1.5 统计分析

每组试验重复3次，每次试验测定3个平行样，结果用SPSS 25.0进行分析处理(P<0.05)，数据作图采用OriginPro8.1软件。

2 结果与分析

2.1 羊肝蛋白的基本表征

经试验测定，羊肝中的粗蛋白质量分数为18.76%，其中WSLP的蛋白质纯度达到90.528%，SSLP的蛋白质纯度达到70.564%，脂肪质量分数为2.19%。

2.2 SDS-PAGE电泳

如图1所示：以Mark为参照，WSLP包含各种高分子量和低分子量的蛋白质，在20～100 kDa的低分子量范围内发现多个条带，主要的蛋白条带分别为34，46，52，63，77 kDa。肌浆蛋白是分子量相对较低的水溶性球状蛋白，主要由糖酵解途径的酶，肌酸激酶和血红素色素组成[19]。WSLP的SDS-PAGE图中还显示了几种高分子量蛋白质，其中主要蛋白质约为110 kDa，它们可能是成肌纤维的片段[20]。

SSLP的SDS-PAGE图谱中显示出高分子量和低分子量的蛋白质。主要的蛋白条带分别为72，63，60，42，101 kDa，然而，与WSLP相比，在低分子量范围内发现较少的蛋白质条带，而在高分子量范围内发现较多的蛋白质条带，SSLP的分子量分布与Nuckles等[21]的研究相似。Steen等[22]将42 kDa的弱条带认为是肌动蛋白条带，试验也具有相似推断。WSLP和SSLP的SDS-PAGE图谱中有相似分子量的谱带，可能是由蛋白质在磷酸盐和NaCl磷酸盐溶液中的部分溶解性所致，也可能是存在具有相同分子量的不同蛋白质[23]。

2.3 热稳定性

由图2可知，WSLP和SSLP的变性温度分别在74.4 ℃ 和87.9 ℃左右，SSLP的热稳定性高于WSLP。

2.4 羊肝蛋白的粒径和Zeta电位

由图3(a)可知，WSLP的粒径在100～1 000 nm处有较为集中的分布。而SSLP的分别在0～100，100～1 000 nm 出现分布，其中在100～1 000 nm出现的单峰，与WSLP的粒径分布很相似。

图1 盐溶性与水溶性羊肝蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Figure 1 The image of protein gel electrophoresis

图2 羊肝蛋白的DSC分析曲线Figure 2 DSC analysis curve of sheep liver protein

图3 羊肝蛋白的粒径和电位分析图Figure 3 Particle size and potential analysis of sheep liver protein

由图3(b)可知，SSLP的Zeta电位总数高于WSLP的，静电相互作用较强，表明SSLP可能更加稳定。

2.5 NaCl质量分数对羊肝蛋白表面疏水性的影响

由表1可知：当NaCl质量分数为0.0%～3.6%时，WSLP和SSLP两类蛋白的表面疏水性会随NaCl质量分数的提高而增加；未添加NaCl时，WSLP的表面疏水性较SSLP低，而NaCl质量分数为1.8%和3.6%时WSLP的表面疏水性却明显高于SSLP，说明NaCl质量分数对WSLP蛋白表面疏水性的影响程度较SSLP的要大。WSLP主要为各种肌浆球蛋白，特别是肌球蛋白相关蛋白，盐离子的添加会使得原本处于蛋白质内部的疏水性氨基酸残基的侧链逐渐暴露于蛋白的外部[24]。带负电荷的Cl-会削弱水分子与蛋白分子间的氢键，促进水分的迁移，进而影响溶液体系中水分的分布；同时Cl-会与肌浆球蛋白丝中带正电荷的氨基酸残基侧链结合，削弱原有蛋白分子内的离子键，改变蛋白结构，促使蛋白分子中疏水基团暴露于蛋白的表面，进而增加其表面疏水性[25]。另外，SSLP主要为各种肌原纤维蛋白，而通常NaCl会促进SSLP各蛋白质的溶解，Thawornchinsombut等[26]研究结果表明鱼的肌原纤维蛋白在NaCl浓度低于0.6 mol/L (3.5%)时，蛋白的表面疏水性没有显著变化，当NaCl浓度高于0.6 mol/L时，其表面疏水性显著增加。

2.6 NaCl质量分数对羊肝蛋白乳化性与乳化稳定性的影响

由图4(a)可知：WSLP和SSLP乳化性随NaCl质量分数(0.0%～3.6%)的增加而降低；未添加NaCl以及NaCl质量分数为1.8%时，WSLP的乳化性均明显高于SSLP，而NaCl质量分数为3.6%时，WSLP的表面疏水性略低于SSLP，说明NaCl质量分数对WSLP乳化性的影响较SSLP的大。

表1 NaCl质量分数对WSLP和SSLP蛋白表面疏水性的影响

小写字母不同表示同一蛋白源不同盐浓度间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同一盐浓度不同蛋白源间差异显著(P<0.05)图4 NaCl质量分数对羊肝蛋白乳化性和乳化稳定性的影响Figure 4 Effect of NaCl concentration on emulsification and emulsification stability of sheep liver protein

由图4(b)可知：不添加NaCl时，WSLP的乳化稳定性高于SSLP；而NaCl质量分数在1.8%和3.6%时，WSLP的乳化稳定性比SSLP的低。这是由于能够迁移到油水界面的蛋白质量降低或蛋白质从界面向连续相的扩散增加导致的，与静电、水合排斥和界面上吸附的蛋白分子之间的空间相互作用有关[27]。Silva等[28]观察到，随着NaCl质量分数(0.0%～1.6%)增加乳液的乳化性降低，可能是由于乳液形成后蛋白质从界面到连续相的扩散增加。Khalid等[29-30]认为NaCl质量分数较低时(0.2%～1.0%)鹰嘴豆和芝麻籽乳化能力的提高，是因为溶解度的提高，而在较高的盐离子质量分数下(1.2%～2.0%)乳化能力的降低，是由于盐析效应。

2.7 NaCl质量分数对羊肝蛋白起泡性与泡沫稳定的影响

由图5可知：NaCl质量分数为0.0%～3.6%时，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫稳定性均呈先增加后降低的趋势。当NaCl质量分数为1.8%时，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫稳定性显著增加，因为此时两种蛋白的表面疏水性增加(如表1所示)，蛋白质在空气/水界面处的相互作用增强，但当NaCl质量分数为3.6%时，WSLP和SSLP的起泡性显著下降，是因为疏水性氨基酸残基向外部空间暴露太多时，蛋白质分子间疏水相互作用增强，进而发生凝聚导致产生空气与水界面蛋白薄膜的蛋白量减少，引发起泡性下降，如Zouari等[31]研究结果显示添加1%的NaCl可提高火鸡肝脏蛋白的起泡性，而当NaCl添加量为2%时，起泡性显著降低。Zou等[32]研究表明起泡性和泡沫稳定性会影响肝酱产品的加工及贮藏。

小写字母不同表示同一蛋白源不同盐浓度间差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示同一盐浓度不同蛋白源间差异显著(P<0.05)图5 NaCl质量分数对羊肝蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Figure 5 Effect of NaCl concentration on foaming property and foam stability of sheep liver protein

3 结论

经提取后的羊肝中含有90.528%的水溶性蛋白和70.564%的盐溶蛋白。水溶性羊肝蛋白的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱以低分子量为主，而盐溶性羊肝蛋白在高分子量范围的条带较多。羊肝盐溶蛋白的热稳定性较高，且粒径分布也较为集中，说明盐溶蛋白的稳定性较高，电位分析也可验证这一结果。添加NaCl可显著降低羊肝水溶蛋白和盐溶蛋白的乳化性和乳化稳定性，而起泡性和泡沫稳定性发生显著的先增加后降低的趋势。