激光照射频次和单次照射时长对眼部组织的损伤作用评估

张宇飞 危冬昱 王伟 刘大铭 任泽 李向前 陈涛 张作明

1空军军医大学航空航天临床医学中心 航空航天医学教育部重点实验室，西安 710032；2海军军医大学海军特色医学中心，上海 200433；3空军军医大学基础医学院，西安 710032

激光已广泛用于各个领域，除工业和医疗用途外，军事等许多特种领域也将激光作为一种重要的工具[1]。由于激光具有相当高的能量，使用不当会对人的视觉系统造成不同程度的损伤，如角膜灼伤、晶状体混浊、视网膜光损伤等，不同的激光波长和能量以及照射方式对视网膜的损伤程度不同[2]。但是，目前关于激光应用的各种安全防护标准还不够完善。在军事领域，激光可作为引导系统对飞行员的飞行作业进行远距离引导，此时在照射区域内是弥散的多光谱激光，与常用的束状光不同。在飞行中，飞行员需要寻找到该光区，并根据光区内的激光光束确立最佳着陆下滑角度和下滑速率，即飞行员在每次降落过程都将在激光暴露下持续飞行一段时间。这种情况下的激光暴露是否会对视觉系统造成损伤或导致工作能力的降低而危及飞行安全是航空医学须待阐明的问题，目前缺少相关的实验证据和相关安全标准。本研究评估不同激光照射频次和单次照射时长对视觉功能的影响，为相关标准的制定提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 选取SPF级雄性豚鼠36只，体质量250～300 g(购自空军军医大学实验动物中心)[实验动物使用许可证：SYXK(军)2017-0045。实验动物生产许可证：SCXK(军)2017-0021]。所有豚鼠进行常规喂养，提供充足饮食，适当补充维生素C，12 h/12 h明暗循环光照。实验动物的饲养和使用符合视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范，研究方案经第四军医大学实验动物中心福利与伦理委员会审核批准(批文号：20181203)。

采用随机数字表法、依据激光照射频次和单次照射时长不同将豚鼠随机分为高频短时(high-frequency-short-time，HFST)组、高频长时(high-frequency-long-time，HFLT)组、中频短时(medium-frequency-short-time，MFST)组、中频长时(medium-frequency-long-time，MFLT)组、低频短时(low-frequency-short-time，LFST)组和低频长时(low-frequency-long-time，LFLT)组。高、中、低频分别定义为激光照射15次、10次和5次，激光照射长时和短时分别定义为60 s/次和30 s/次。各组照射频次以及时长根据飞行训练大纲要求的训练次数以及飞机着陆所需时间进行换算制定。

1.1.2主要试剂及仪器 复方托吡卡胺滴眼液、加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐制药有限公司)；盐酸奥布卡因滴眼液、左氧氟沙星滴眼液[日本参天制药(中国)有限公司]；维生素C片(西安利君制药有限公司)。Schirmer泪液试纸条(天津晶明新技术开发有限公司)；激光引导光源(中国科学院自制)；视觉电生理记录仪(德国Roland 公司)；眼底图像记录系统(加拿大 Optoprobe公司)；裂隙灯显微镜(苏州六六视觉科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1豚鼠眼激光照射 激光引导器在距离豚鼠眼部约0.5 m处(利用照度计对激光照度测量后进行距离调整，直至豚鼠眼部位置照度为500 lx后固定激光引导器以及豚鼠的位置)对豚鼠眼进行照射。豚鼠右眼用复方托吡卡胺滴眼液点眼扩瞳，在清醒状态下按照分组方案进行500 lx激光照射，每次照射间隔10 min，左眼不接受任何干预作为对照眼。

1.2.2基础泪液分泌试验检测豚鼠泪液分泌量 于激光照射后12 h采用基础泪液分泌试验(SchirmerⅠtest，SⅠt)检测豚鼠泪液分泌量。将Schirmer泪液试纸宽度裁剪为宽约1.5 mm后，将前端约2 mm处折叠成直角，夹在豚鼠下眼睑内侧1/3处结膜囊内，另一端垂挂在下眼睑外部，轻闭双眼5 min，取出试纸条，放置2 min后观察并记录试纸条浸湿长度。

1.2.3裂隙灯显微镜下观察豚鼠晶状体混浊情况 于激光照射后12 h采用裂隙灯显微镜斜照法观察豚鼠双眼晶状体混浊程度。晶状体混浊评分标准：晶状体形态正常且透明为0分；晶状体轻度混浊为1分；晶状体明显混浊为2分；晶状体为白色或出血为3分。

1.2.4眼底照相法评估眼底变化 于激光照射后12 h采用戊巴比妥钠将豚鼠麻醉后固定于操作台，眼表涂抹加替沙星眼用凝胶保护角膜。将眼底照相镜头对准动物瞳孔，调节成像焦距，移动操作台至视盘位于镜头视野中央，待成像清晰时拍照。观察视盘结构是否正常、眼底是否有渗出及出血。

1.2.5视网膜电图检查评估豚鼠视网膜功能 于激光照射后12 h采用罗兰电生理操作系统按标准化操作流程[4]记录视网膜电图(electroretinogram，ERG)。检测前豚鼠在暗环境下暗适应12 h，采用质量分数1%戊巴比妥钠和50 μl质量分数50%陆眠宁腹腔内注射进行麻醉，剂量为3 ml/kg，采用复方托吡卡胺滴眼液点眼扩瞳，采用盐酸奥布卡因滴眼液点眼行角膜表面麻醉，用棉签轻拭多余水分。将豚鼠置于操作台，作用电极为Ag-AgCl角膜环状电极，置于角膜表面，参考电极为不锈钢针状电极，刺于颊部皮下，地电极为不锈钢针状电极，刺入尾部皮下[4]。红光下记录暗适应3.0条件下暗视ERG反应。记录后用左氧氟沙星滴眼液点眼，分析暗适应3.0条件下ERG a波及b波振幅值。

1.2.6视网膜组织病理学检查 采用颈椎脱臼法处死豚鼠，以墨汁在眼球12：00方向进行标记，摘取眼球并保留一定长度的视神经，置于眼球固定液(Division液)中固定48 h，脱水包埋。包埋时将眼球标本的角巩膜缘贴于金属盒底面，并将染料标记点置于顶端。沿眼球矢状位进行连续切片，切片厚度为4 μm，选取通过视神经的切片进行捞片，70 ℃烤片4 h，苏木精-伊红染色。光学显微镜400倍视野下选取距离视神经约500 μm处垂直外核层，用显微测量软件测量视网膜外核层厚度，重复测量3次，取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件(美国SPSS公司)进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验对计量资料的数据进行正态分布检验，符合正态分布的数据资料采用mean±SD表示，采用Levene检验对各组数据进行方差齐性检验；偏态分布的数据资料采用M(Q1，Q3)表示。实验眼与对照眼间ERG a、b波振幅和视网膜外核层厚度差异比较采用配对t检验，2个组间泪液分泌量差异比较采用Wilcoxon符号秩检验；6个不同激光照射组间ERG a、b波振幅及视网膜外核层厚度总体差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验；6个不同激光照射组间泪液分泌量总体差异比较采用Kruskal-WallisH检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验眼与对照眼豚鼠泪液分泌量比较

激光照射后12 h，HFST组、HFLT组、MFST组、MFLT组、LFST组和LFLT组豚鼠实验眼与对照眼间泪液分泌量比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。

表1 各组对照眼与实验眼泪液分泌量比较[M(Q1,Q3),mm/5min]Table 1 Comparison of tear secretion between control eyes and experimental eyes in various groups[M(Q1,Q3),mm/5min]眼别各组泪液分泌量HFST组(n=6)HFLT组(n=6)MFST组(n=6)MFLT组(n=6)LFST组(n=6)LFLT组(n=6)对照眼8.25(7.50,8.75)8.75(8.00,9.00)8.75(7.62,9.12)8.50(8.00,9.50)8.50(7.62,9.12)8.50(7.50,9.00)实验眼8.00(7.37,9.00)8.75(8.25,9.00)8.50(7.75,9.50)9.00(8.50,9.50)8.00(7.37,8.75)8.25(7.75,8.75)Z值0.7070.0000.5771.3000.6380.333P值0.4081.0000.5640.1940.5240.739 注:(Wilcoxon符号秩检验) HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(Wilcoxon sign rank test) HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

2.2 不同激光辐照组间实验眼泪液分泌量比较

激光照射后12 h，各组间豚鼠实验眼泪液分泌量总体比较差异无统计学意义(χ2=5.502，P=0.240)(表2)。

表2 各组豚鼠实验眼泪液分泌量比较[M(Q1,Q3),mm/5min]Table 2 Comparison of tear secretion of experimental eyes among various groups[M(Q1,Q3),mm/5min]组别样本量泪液分泌量HFST组68.00(7.37,9.00)HFLT组68.75(8.25,9.00)MFST组68.50(7.75,9.50)MFLT组69.00(8.50,9.50)LFST组68.00(7.37,8.75)LFLT组68.25(7.75,8.75)χ2值5.502P值0.240 注:(Kruskal-Wallis H 检验) HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(Kruskal-Wallis H test) HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

2.3 不同激光辐照组豚鼠晶状体表现

激光辐照后12 h，各组豚鼠晶状体均透明，晶状体混浊度评分均为0分(图1)。

图1 激光照射后12 h各组豚鼠晶状体表现 各组豚鼠激光照射眼和对照眼晶状体均透明HFST：高频短时；HFLT：高频长时；MFST：中频短时；MFLT：中频长时；LFST：低频短时；LFLT：低频长时Figure 1 Performance of lens of guinea pigs among various groups at 12 hours after laser irradiation The lenses of both eyes of the guinea pigs were clear in various groupsHFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

2.4 不同激光辐照组豚鼠视网膜表现

激光照射后12 h，各组豚鼠激光照射眼和对照眼眼底可见视盘结构清晰，未见视网膜出血和渗出(图2)。

图2 激光照射后12 h各组豚鼠眼底照片 各组豚鼠双眼视网膜和视盘形态正常HFST：高频短时；HFLT：高频长时；MFST：中频短时；MFLT：中频长时；LFST：低频短时；LFLT：低频长时Figure 2 Fundus images of guinea pig eyes among various groups at 12 hours after laser irradiation The retina and optic disc of the both eyes of guinea pigs were normal in various groupsHFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

2.5 各组内实验眼与对照眼间ERG a、b波振幅比较

不同激光辐照组豚鼠对照眼与实验眼间ERG a波振幅值差异均无统计学意义(均P>0.05)。

HFST组和HFLT组中豚鼠实验眼暗视3.0ERG反应b波振幅值低于对照眼，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其他各组豚鼠实验眼与对照眼间暗视3.0ERG反应b波振幅值差异均无统计学意义(均P>0.05)(图3，表3，4)。

图3 激光照射后12 h各组豚鼠双眼暗视3.0ERG反应典型波形HFST：高频短时；HFLT：高频长时；MFST：中频短时；MFLT：中频长时；LFST：低频短时；LFLT：低频长时Figure 3 Scotopic 3.0 ERG of both eyes of experimental animals at 12 hours after laser irradiationHFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

表3 各组实验眼与对照眼间ERG a波振幅值比较(mean±SD,μV)Table 3 Comparison of ERG a-wave amplitude between control eyes and experimental eyes in each group(mean±SD,μV)眼别各组ERG a波振幅HFST组(n=6)HFLT组(n=6)MFST组(n=6)MFLT组(n=6)LFST组(n=6)LFLT组(n=6)对照眼51.18±21.4947.85±20.3962.43±22.6458.62±24.3262.33±14.2760.50±10.67实验眼41.01±16.0938.68±12.3146.42±21.2833.70±8.6067.83±9.4761.66±5.64t值0.7301.6921.6482.1860.6950.214P值0.4980.1520.1600.0810.5390.839 注:(配对t检验) ERG:视网膜电图;HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(Paired t test) ERG:electroretinogram;HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

表4 各组实验眼与对照眼间ERG b波振幅值比较(mean±SD,μV)Table 4 Comparison of ERG b-wave amplitude between control eyes and experimental eyes in each group(mean±SD,μV)眼别各组ERG b波振幅HFST组(n=6)HFLT组(n=6)MFST组(n=6)MFLT组(n=6)LFST组(n=6)LFLT组(n=6)对照眼125.00±15.17121.32±31.76118.03±45.94140.65±32.77124.33±2.62125.33±2.21实验眼96.45±21.5786.38±29.79112.28±29.43114.02±54.21117.83±3.71123.83±8.35t值3.6265.0190.3221.3661.2100.229P值0.0150.0040.7600.2300.2800.777 注:(配对t检验) ERG:视网膜电图;HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(Paired t test) ERG:electroretinogram;HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

2.6 不同激光辐照组间豚鼠实验眼ERG波形变化

激光照射后12 h，HFST组、HFLT组、MFST组、MFLT组、LFST组和LFLT组间豚鼠实验眼ERG a波振幅值总体比较差异有统计学意义(F=6.269，P<0.01)，其中高频照射组ERG a波幅值低于低频照射组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组豚鼠实验眼ERG b波振幅值总体比较差异无统计学意义(F=1.358，P=0.268)(表5)。

表5 各组间实验眼ERG a、b波振幅值比较(mean±SD,μV)Table 5 Comparison of ERG a-,b-wave amplitudes of experimental eyes among various groups(mean±SD,μV)组别样本量a波振幅b波振幅HFST组641.01±16.09ab96.45±21.56HFLT组638.68±12.31ab86.38±29.78MFST组646.42±21.28112.28±29.42MFLT组633.70±8.60114.01±54.20LFST组667.83±9.47117.83±9.10LFLT组661.66±5.64123.83±8.35F值6.2691.358P值<0.010.268 注:与LFST组比较,aP<0.05;与LFLT组比较,bP<0.05(单因素方差分析,Tukey检验). ERG:视网膜电图;HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:Compared with the LFST group,aP<0.05;Compared with the LFLT group,bP<0.05(One-way ANOVA,Tukey test). ERG:elec-troretinogram;HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequen-cy-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-fre-quency-long-time

2.7 不同激光辐照组豚鼠视网膜组织形态学变化

激光照射后12 h，各组豚鼠视网膜结构清晰，细胞形态正常，排列紧密。距离视神经500 μm处视网膜外核层厚度测量结果比较差异无统计学意义(P>0.05)(图4，表6，7)。

图4 各组豚鼠视网膜形态学变化(HE ×400，标尺=30 μm) 各组豚鼠实验眼和对照眼视网膜结构均正常HFST：高频短时；HFLT：高频长时；MFST：中频短时；MFLT：中频长时；LFST：低频短时；LFLT：低频长时Figure 4 Morphological findings of binocular retina in each group(HE ×400,bar=30 μm) The morphology of the retinas of both experimental eyes and control eyes in various groups was normalHFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

表6 各组豚鼠对照眼与实验眼间视网膜外核层厚度比较(mean±SD,μm)Table 6 Comparison of retinal outer nuclear layer thickness between control eyes and experimental eyes in each group(mean±SD,μm)眼别各组视网膜外核层厚度HFST组(n=6)HFLT组(n=6)MFST组(n=6)MFLT组(n=6)LFST组(n=6)LFLT组(n=6)对照眼28.95±5.5827.08±1.1928.05±1.5827.12±2.2427.12±2.0128.54±2.23实验眼26.62±2.5828.10±1.5728.86±1.8226.60±3.1928.16±1.2227.23±2.65t值1.4791.3410.6830.4982.2811.528P值0.1990.2380.5250.6400.0850.201 注:(配对t检验) HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(Paired t test) HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medi-um-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

表7 各组间豚鼠实验眼视网膜外核层厚度比较(mean±SD,μm)Table 7 Comparison of retinal outer nuclear layer thickness of experimental eyes among various groups(mean±SD,μm)组别样本量视网膜外核层厚度HFST组626.62±2.58HFLT组628.10±1.57MFST组628.86±1.82MFLT组626.60±3.19LFST组628.16±1.22LFLT组627.23±2.65F值0.952P值0.463 注:(单因素方差分析) HFST:高频短时;HFLT:高频长时;MFST:中频短时;MFLT:中频长时;LFST:低频短时;LFLT:低频长时 Note:(One-way ANOVA) HFST:high-frequency-short-time;HFLT:high-frequency-long-time;MFST:medium-frequency-short-time;MFLT:medium-frequency-long-time;LFST:low-frequency-short-time;LFLT:low-frequency-long-time

3 讨论

本研究结果表明500 lx的激光照射增加到15次时，虽然视网膜形态并未发生明显异常，但照射眼视网膜功能轻度下降，主要表现为暗视3.0ERG反应b波振幅值下降，高频照射眼暗视3.0ERG反应a波振幅值较低频照射眼降低。由于人眼中的色素分布以及各组织的含水量不同，使得激光照射对眼不同部位有不同的损害作用[6-8]。既往研究表明，高强度光照容易导致视网膜光损伤，损伤程度呈阈值效应且与能量存在剂量效应，尤其是可见光对视网膜的破坏性最大，可表现为视网膜外核层变薄和视觉电生理反应下降[9-11];但针对照射频次的研究目前仍少见。本研究所用激光是可见光，当光强度超过视网膜负荷时，会诱导视网膜内发生氧化应激反应以及离子分布和蛋白的改变，视网膜内细胞结构发生破坏，导致视网膜光损伤[12-14]。研究发现，高强度光照能够通过一系列信号通路引起视网膜细胞的凋亡并影响细胞的自噬作用，视网膜细胞的生理功能发生紊乱[15-17]。本研究所用激光照度远低于常用视网膜光损伤动物模型的光照度，可能属于阈下激光刺激所致的视网膜功能下降，而视网膜形态并未发生明显改变。

本研究结果表明，这种阈下激光所致视网膜功能下降主要与激光照射频次有关。研究表明，中等强度光预刺激对视网膜光感受器细胞光损伤具有保护作用[18-19]，而短期内较高强度的阈下光照刺激无法激发视网膜光感受器细胞对较强光照的耐受，可能会导致视网膜光感受器细胞功能的生理性紊乱。单次照射时长无论是30 s还是60 s，感光细胞中的视色素都只发生一次广泛的分解与合成，而2次激光刺激间隔10 min足以使视网膜视色素重新合成。短时间内视色素频繁而广泛的分解和合成增加了视网膜内氧化应激反应水平，最终导致视网膜功能下降。除此之外，这种阈下激光的视网膜损伤也可能与瞬时型神经节细胞的作用有关，而与持续型神经节细胞的关系不大。与此同时，有研究表明间歇光照比连续光照导致更大程度的光感受细胞损伤,视紫红质等物质的下降亦较连续光照组为甚[2]。

综上所述，在500 lx照度的激光照射条件下，单次照射时长<1 min、10次以下的照射频率相对未照射眼来说对视觉功能和眼部组织是安全的，但是超过10次以上的照射频率可能会损害视觉功能，而超过15次的激光照射频率则会导致明显的视功能降低。高频率激光照射相较于低频率照射所导致的视功能降低幅度更大，意味着500 lx照度的激光照射对视功能的影响存在频率相关性。因此对于此类激光的照射防护标准应当在控制照射时间的同时，加强对照射次数的限制。

利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明本课题为第三作者单位的联合项目，项目中视觉研究部分由所有作者共同参与完成。张作明、陈涛、王伟参与选题、研究设计、项目指导、文章科学内容修改和最终定稿；张宇飞、危冬昱、任泽、李向前、刘大铭参与研究设计、研究实施、文章写作和修改