草鱼白介素10基因的克隆表达及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

胡忠俊，周 昊，吕丽丽，李槿年

草鱼白介素10基因的克隆表达及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

胡忠俊，周 昊，吕丽丽，李槿年*

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)

为建立检测草鱼白介素10（IL-10）的双抗体夹心ELISA方法，首先克隆IL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒pET-32a-IL-10，并对表达产物进行纯化，以获得重组IL-10（rIL-10）纯化蛋白。然后，以纯化的rIL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗rIL-10的多克隆抗体，并对其进行纯化与酶标记。最后，以纯化的鼠抗rIL-10抗体为捕获抗体，rIL-10纯化蛋白为夹心抗原，HRP标记的兔抗IL-10纯化抗体为检测抗体，通过优化反应条件，建立双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示，该方法的优化反应条件包括，捕获抗体的最佳包被浓度为20 μg·mL-1，检测抗体的最佳稀释度为1∶3 200，最佳封闭条件是使用5%脱脂奶粉，37 °C封闭1.5 h，样品反应时间为2 h，以450值≥0.174作为阳性判定标准。该方法的板内及板间重复性变异系数小于10%，最低检测限量为24.29 ng·mL-1，与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应。结果表明，建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度，可用于草鱼白介素10的快速检测。

草鱼白介素10；克隆表达；抗体制备；双抗体夹心ELISA

白介素-10（Interleukin 10，IL-10）是一种由单核巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、CD8+T细胞和NK细胞等细胞分泌的多功能免疫调节因子，参与多种细胞和疾病的生物调节[1-4]。IL-10不仅具有抑制调节性T细胞增殖、促炎因子的合成与抗原递呈等免疫抑制作用，还可发挥促进肥大细胞、NK细胞和B细胞的活化和分化，增强单核巨噬细胞的吞噬作用[5-7]。……