CDC42抑制剂CASIN对食管癌细胞活力与迁移能力的抑制作用

陈婉娴，王思梦 ，陈张瑜 ，王潘集，郑淳文 ，李恩民，*，许丽艳

(1.汕头大学医学院基础医学研究所，广东汕头 515041；2.汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，广东 汕头 515041)

食管癌是常见的上消化道恶性肿瘤，是全球十大恶性肿瘤之一。全世界每年约有40 余万人死于食管癌，我国是食管癌高发国，每年约一半的食管癌新发病例在我国。食管癌患者的预后差，5 年生存率仅15%左右，主要原因是缺少抗食管癌的特异性分子靶向药物。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)是小G 蛋白Rho 家族的核心成员，在与GTP 结合/活化状态和与GDP 结合/失活状态之间循环切换，发挥“ON/OFF”开关作用。有研究报道，CDC42与细胞分裂、细胞侵袭、细胞伪足形成和细胞极性等密切相关，在细胞恶性演进中发挥重要的调控作用，这提示从分子水平上深入研究CDC42在肿瘤细胞恶变中所扮演的角色，将有助于明确CDC42抑制剂在肿瘤治疗中的作用。已知CASIN是一个靶向CDC42的小分子抑制剂，通过抑制CDC42上的鸟嘌呤核苷酸交换而发挥作用。近年来，有报道将CASIN 用于临床过敏性气道炎症和哮喘的治疗。随着对CDC42在恶性肿瘤中作用机制研究的不断深入，CASIN 用于恶性肿瘤治疗的前景已被充分展现。故本实验拟探讨CDC42抑制剂CASIN对食管癌细胞活力与迁移的抑制作用，为将来CASIN作为新型分子靶向药物应用于临床抗食管癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

CDC42鼠抗(Cytoskeleton公司)，Beta Actin单克隆抗体和HRP偶联的二抗(Proteintech公司)，FastPfu DNA聚合酶(北京全式金公司)，琼脂糖凝胶回收试剂盒和无内毒素质粒小提试剂盒(Biomiga 公司)，Flag-CDC42 质粒(本实验室保存，携有氨苄霉素抗性基因，Flag 标签，

CDC42

基因编码序列全长)，Lipofectamine 3000 转染试剂(Thermo Scientific 公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，CASIN(Med ChemExpress 公司，溶解于100%DMSO 保存)，胰酶、RMPI 1640 培养基和 DMEM 培养基(Hyclone 公司)，细胞增殖试剂盒(Promega 公司)，OD600蛋白含量测定试剂盒(Pierce公司)，凋亡抗体试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 筛选食管癌细胞模型

使用SDS 裂解液分别提取9 种食管癌细胞系TE1、TE3、KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450、KYSE510 和Colo680N 中总蛋白。100 ℃煮沸5 min。蛋白变性后，以每泳道15 μL 蛋白进行SDS-PAGE 电泳。电泳后，转至聚偏二氟乙烯膜，将其置于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别加CDC42 鼠抗(1∶250)、β-actin 单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST 缓冲液洗膜后，HRP 偶联的二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h。TBST 缓冲液洗膜后，加入ECL 显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照，然后选用CDC42内源性高表达和低表达食管癌细胞系各2 种，在37 ℃、CO体积分数为5%的湿润培养箱中培养。

1.3 构建GFP-CDC42重组表达载体

根据NCBI 检索的

CDC42

基因序列和pEGFP 的多克隆酶切位点，利用Snap Gene 软件设计PCR 引物(上游 引 物 F： 5′-CTCAGATCTCGAGCTATGCAGACAATT AAGTGTGTTGTTGT-3′；下游引物 R：5′-TCGACTG CAGAATTCTCATAGCAGCACACACCTGC-3′)。引物由天一辉远公司合成，以Flag-CDC42 重组质粒为模板，使用FastPfu DNA聚合酶反应体系进行PCR扩增(扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃、20 s，58 ℃、20 s，72 ℃、40 s，共循环 30 次，72 ℃延伸 5 min)，PCR产物经加入Goodview染色剂的1.5%琼脂糖凝胶电泳(40 V，15 min)，在紫外观测仪上观察电泳结果。按照试剂盒说明书对PCR 产物进行纯化回收。然后，先用内切酶

Eco

R I，

Xho

I处理pEGFP-C1质粒，再用外切酶

EXo

Ⅲ处理PCR产物及pEGFP-C1质粒，转入

Trans5

α感受态细胞，涂布在培养基上；挑取白色菌落，使用带染料的2×Taq PCR StarMix 反应体系进行菌落PCR 鉴定(扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、40 s，共循环30次，72 ℃延伸5 min)，使用琼脂糖电泳鉴定，方法同上；之后，根据菌落PCR结果，挑选影印板上的阳性克隆菌落，用无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，限制性内切酶(

Eco

R I和

Xho

I)酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，方法同上；最后送华大基因公司对重组质粒测序，确定表达载体构建是否成功。

1.4 细胞转染和分组

使用Lipofectamine 3000试剂进行转染，操作方法按照说明书进行。转染Flag-CDC42质粒的细胞命名为Flag-CDC42 组，转染Flag 空载体对照的细胞命名为Flag 组；转染GFP-CDC42 质粒的细胞命名为GFPCDC42 组，转染GFP 空载体对照的细胞命名为GFP组。

1.5 细胞活力分析

在内源性CDC42高/低表达组中，分别将4种食管癌细胞系(KYSE30、KYSE510、KYSE150 和 TE1)接种到96孔板中，1×10个/孔，待细胞培养至贴壁后，分别加入完全培养基和不同浓度的CASIN，实验分为空白对照组，阴性对照组和CASIN 1.875、3.75、7.5、15、30、60 μmol/L 实验组，处理细胞24 h。每组3个平行孔，实验至少重复3次。

在外源性CDC42 高/低表达组中，将转染Flag 或Flag-CDC42 的 2 种食管癌细胞系(KYSE510 和 TE1)接种到96 孔板中，1×10个/孔，待细胞培养至贴壁后，分别加入完全培养基和0、20 μmol/L的CASIN，实验分为空白对照组，阴性对照组和20 μmol/L 的CASIN组，处理细胞24 h。每组3 个平行孔，实验至少重复3 次。之后根据说明书，每个孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 mg/mL)，使用Biotek EL×800 酶标仪检测每个孔在490 nm处的吸光度，并计算细胞存活率。

细胞存活率=[

D

(490)-

D

(490)]/[

D

(490)-

D

(490)]×100%

1.6 划痕实验

在内源性CDC42高/低表达组中，将上述4种食管癌细胞系接种至12 孔板中，3.5×10个/孔，贴壁后饥饿12 h，用200 μL 枪头尖端进行划痕，分别加入0、15和30 μmol/L的CASIN，处理细胞24 h后，拍照。

在外源性CDC42 高/低表达组中，将转染Flag 或Flag-CDC42 的2 种食管癌细胞系接种接种至12 孔板中，3.5×10个/孔，贴壁后饥饿12 h，用200 μL枪头尖端进行划痕，分别加入0和20 μmol/L的CASIN，处理细胞24 h后，拍照。

在指定区域显微成像，用ImageJ 软件分析创面愈合情况。重复3次实验。计算愈合率。

愈合率=(划痕初始面积-培养后的划痕面积)/划痕初始面积×100%

1.7 Western blot 检测 Caspase-3 和 PARP 蛋白表达情况

在内源性CDC42 高/低表达组中，细胞用CASIN抑制剂处理24 h后，经SDS裂解液裂解，提取细胞蛋白，并使用OD600 蛋白试剂盒检测蛋白含量。Western blot 操作方法按说明书进行。蛋白经SDSPAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯膜，将其置于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别加PARP 抗体(1∶2 000)、Caspase-3 抗体(1：1 000)、Beta-Actin 单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后，HRP偶联的二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h。TBST 缓冲液洗膜后，加入ECL显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.8 免疫荧光检测细胞伪足的形成

在外源性CDC42 高/低表达组中，将转染pEGFP或pEGFP-CDC42 的2 种食管癌细胞系(KYSE30 和KYSE150)接种至 12 孔板中，3.5×10个/孔，待细胞培养至贴壁后，加入CASIN(KYSE30 细胞系采用0 和15 μmol/L的CASIN；KYSE150细胞系采用0和20 μmol/L的CASIN)，处理细胞24 h。取出培养板后，用PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100通透30 s，再用25 μg/mL荧光素标记鬼笔环肽(Actinstain555 Fluorescent Phalloidin)染色 40 min，PBS 洗3次，封片，蔡司800共聚焦显微镜下拍照成像。

1.9 数据分析

2 结 果

2.1 内源性CDC42 蛋白高、低表达食管癌细胞模型的筛选结果

Western blot 检测结果见图1，CDC42 蛋白在不同食管癌细胞系中表达存在明显的差异。基于此，从中选择KYSE30和KYSE510(CDC42内源性高表达)，以及KYSE150和TE1(CDC42内源性低表达)共4种细胞进行后续的实验研究。

图1 Western blot检测CDC42蛋白在9种不同食管癌细胞系中的表达

2.2 CASIN影响内源性高/低表达CDC42食管癌细胞的活力和迁移能力

CASIN 对上述4 种食管癌细胞系细胞活力的影响见图 2A～D。与对照组(即 CASIN 浓度为 0 μmol/L)比较，当CASIN为低浓度(0～7.5 μmol/L)时，细胞的活力 不 降 反 升 (

P

＜0.05)； 而 当 CASIN 为 高 浓 度 (15～60 μmol/L)时，细胞的活力显著降低(

P

＜0.05)。基于本文的研究目标，将CASIN 的浓度设置在较高的15～30 μmol/L，以此开展后续的研究。随后，通过划痕实验(图2E～H)发现，处理24 h 后，与对照组相比，15 μmol/L CASIN，可明显抑制KYSE150、KYSE510和TE1 这3 种食管癌细胞的迁移能力(

P

＜0.05)；对于KYSE30食管癌细胞，15 μmol/L的CASIN虽然也抑制其迁移能力，但差异不显著，说明不同的食管癌细胞对于CASIN 的抑制作用不同。30 μmol/L 的CASIN，对于 KYSE150、KYSE510、TE1 和 KYSE30 这 4 种食管癌细胞，抑制效果较15 mol/L 时均明显增强(

P

＜0.01)。

图2 细胞活力分析和划痕实验结果(n=3，)

2.3 CASIN诱导内源性高/低表达CDC42的食管癌细胞发生细胞凋亡

图3 CASIN 诱导食管癌细胞Caspase-3 高表达及促进PARP 蛋白裂解的Western blot检测结果

Western blot 检测结果见图3。可见，与对照组(0 μmol/L的CASIN)比较，15和30 μmol/L的CASIN均可以明显促进食管癌细胞(KYSE150和KYSE30)凋亡酶Caspase-3 高表达，同时显著促进了Caspase-3 底物蛋白PARP 的裂解。由此，推测CASIN 可能通过激活凋亡酶Caspase-3的表达，促进其底物蛋白PARP裂解的细胞信号通路，诱导食管癌细胞发生凋亡，抑制食管癌细胞的活力和迁移能力。

2.4 GFP-CDC42重组表达载体成功构建

扩增的CDC42 片段经回收后，与pEGFP 载体连接，获得的重组质粒pEGFP-CDC42经

Eco

R I和

Xho

I双酶切鉴定，结果提示(图4A)，重组表达载体中外源片段的长度(576 bp)同理论CDC42编码区的长度一致，表明已成功构建重组表达载体pEGFP-CDC42。测序结果(图4B)亦显示扩增序列与GenBank中的完全一致。

图4 GFP-CDC42重组表达载体成功构建

2.5 CASIN抑制外源性CDC42高表达食管癌细胞的活力和迁移能力

从图5 可见，与对照组(0 μmol/L 的CASIN)相比，20 μmol/L的CASIN作用后，2种食管癌细胞的活力和迁移能力均被显著抑制(

P

＜0.05)。此外，从图5A、5B和5F可见，当CASIN浓度为0时，与转染Flag质粒组相比，转染Flag-CDC42质粒组细胞的活力和迁移能力可以明显增加(

P

＜0.05)；而用20 μmol/L的CASIN处理24 h后，可以削弱CDC42对细胞活力和迁移能力的增强作用(

P

＜0.05)。

图5 CASIN抑制外源性CDC42高表达食管癌细胞活力和迁移能力的检测结果(n=3，)

2.6 CASIN影响外源性CDC42高表达食管癌细胞伪足的形成

本研究成功构建pEGFP-CDC42 绿色荧光标签表达载体后，将其转染至KYSE150 和KYSE30 食管癌细胞中，利用细胞免疫荧光实验观察(图6)发现，与GFP对照组相比，GFP-CDC42 组细胞的伪足数量增多，伪 足的长度变长；与此同时，用15 或20 μmol/L 的CASIN处理24 h，可使CDC42高表达食管癌细胞伪足变多变长的效果被明显抵消。

图6 CASIN影响外源性CDC42高表达食管癌细胞伪足形成的免疫荧光实验观察结果(×40)

3 讨 论

迄今为止，同步放化疗依然是局部晚期不可手术切除食管癌的标准治疗方法。但是，放化疗的非选择性与毒副作用严重影响着患者的预后。相比较而言，分子靶向药物可以选择性地作用于与肿瘤细胞相关的靶点分子，相应地减少毒性反应，因此，可以明显提高疗效。基于此，本研究以我国发病率高且缺少分子靶向药物的食管癌为研究对象，以CDC42为分子靶点，采用CDC42抑制剂CASIN，探究其对食管癌细胞的抑制作用，为将CASIN最终开发成抗食管癌的分子靶向药物奠定实验基础。

首先，本研究采用细胞活力实验和划痕实验检测发现，给予一定浓度(15～30 μmol/L)的CASIN，能够明显抑制食管癌细胞的活力和迁移能力。其次，为了明确CDC42表达能够增强食管癌细胞的活力和迁移能力，进一步构建了外源性CDC42高表达的食管癌细胞模型；结果发现，CDC42高表达的确可以显著增强食管癌细胞的活力和迁移能力。此外，CDC42外源性高表达的食管癌细胞，其受到CASIN 抑制作用的程度，明显强于CDC42低表达的对照组食管癌细胞。由此可见，CDC42在食管癌细胞的恶性演进中发挥着重要的调控作用，而CDC42抑制剂CASIN被开发成用于治疗食管癌的分子靶向药物有现实的研究价值。

已知CDC42是重要的细胞信号网络开关，研究确定CASIN抑制食管癌细胞活力和迁移能力的分子作用机制，可在理论上解释CASIN 可抑制食管癌的增殖。近年有关肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤的研究报道提示，CDC42 的作用与抗肿瘤细胞凋亡有密切关系。基于此，结合本文所获得的实验结果推测，给予一定浓度的CASIN处理食管癌细胞，阻断细胞的CDC42激活信号，抑制CDC42 的激活，最终可引起Caspase-3 表达增加，裂解PARP，可能诱导了食管癌细胞发生凋亡。与此同时，在实验中还发现，CDC42高表达能够促进食管癌细胞的伪足明显变多变长，表明CDC42有促进食管癌细胞伪足形成的作用，而CASIN 可使CDC42 高表达的食管癌细胞伪足形成的作用被明显削弱。

综上，一定浓度(15～30 μmol/L)的CASIN 可阻断食管癌细胞CDC42信号激活，使细胞的活力和迁移能力明显下降，抑制细胞伪足的形成，并最终可能诱导细胞发生凋亡。CDC42是一种有潜力的食管癌分子靶点，其抑制剂CASIN有望被研究开发成一种新型的抗食管癌的分子靶向药物。