9 株分离自住院患者的CA-MRSA 基因型菌株的分子特征及耐药性研究

王院霞，姚锂凤，郑巧平，陈 旭

（上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科，上海 200011）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是引起医院感染和社区感染的重要病原体，可导致皮肤软组织感染（如疖、痈、手术伤口感染、创面感染）和侵袭性感染（如骨髓炎、关节炎、脓毒症）等[1-4]。MRSA 感染于1961 年由英国首次报道，后相继在其他国家出现，并在全球的医院环境中流行传播。20 世纪90 年代起，MRSA 不再局限于医院或医疗环境中，世界各地相继报道了社区获得MRSA（community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus,CA-MRSA）感染[5-7]。由此，MRSA 可以分为医疗机构获得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（healthcare-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus，HA-MRSA）和CA-MRSA。HA-MRSA 与CA-MRSA在分子特征、耐药性及毒力因子等方面均具有一定差异。我国HA-MRSA 克隆一般携带葡萄球菌盒式染色体基因mec （Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）Ⅱ和Ⅲ，而CA-MRSA 一般携带SCCmec Ⅳ和Ⅴ。HA-MRSA 通常具有多重耐药性，而CA-MRSA 一般仅对β-内酰胺类抗生素耐药；CA-MRSA 通常携带较多的毒力基因[如杀白细胞素基因 （panton-valentine leukocidin gene,pvl 基因）]，具有较强的致病性。随着人群（主要为患者）在医院环境和社区环境中的相互流通，CA-MRSA也开始逐渐进入医院环境中，并引起相应的感染，且随着CA-MRSA 菌株的进化，CA-MRSA 开始对多种非β-内酰胺类抗生素产生耐药性。本研究收集2014 年4 月至2015 年12 月期间住院患者临床分离的CA-MRSA 菌株，并对其进行分子特征和耐药性分析，目前国内尚无类似报道，为进一步监测CA-MRSA 流行、治疗提供研究基础。

材料与方法

一、材料

收集2014 年4 月到2015 年12 月期间符合CA-MRSA 诊断标准的住院患者临床分离的金黄色葡萄球菌菌株，采用VITEK-2 鉴定系统（生物梅里埃公司，法国）进行鉴定。菌株纯化后保存于含30%甘油的肉汤中，置于-80 ℃深低温冰箱内保存。CAMRSA 感染诊断依据美国疾病预防控制中心在2003 年公布的CA-MRSA 的诊断标准，具体如下。①在门诊或入院后48 h 内的送检标本中检测出MRSA；②患者在过去1 年内无住院、无外科手术、无透析、无人住家庭病房、无使用护理设施等；③患者无持续性留置导管或经皮进入身体的医疗装置。同时符合以上条件者可诊断为CA-MRSA 感染。

二、方法

1.SCCmec 分型：根据SCCmec 中ccr 基因复合物和mec 基因复合物的不同（见表1），采用PCR 检测ccr1-5、mec1 基因（mec 复合物A）、IS1272-mecR1基因（mec 复合物B）和IS431-mecA 基因（mec 复合物C2）。

表1 不同SCCmec 分型的基因结构组成

2.金黄色葡萄球菌A 蛋白（Staphylococcus protein A，SPA）基因分型：扩增并测序spa 基因X区域的重复序列，根据重复序列的数目、排列进行分型（https://spa.ridom.de/index.shtml）。

3.多位点序列分型 （multilocus-sequence typing，MLST）：检测金黄色葡萄球菌7 个管家基因，与标准序列（http://saureus.mlst.net/）进行比对，得到相应的序列号，根据不同管家基因序列号组合得到相应的序列型（ST）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并测序。

4.药物敏感试验：参照美国临床和实验室标准协会 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南，采用纸片扩散法检测菌株对青霉素、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、红霉素、克林霉素、磺胺甲唑、利福平、利奈唑胺、莫匹罗星、夫西地酸和替考拉宁等药物的敏感性；诱导性克林霉素耐药试验采用D-试验法检测，ATCC25923 作为质控菌株。

5.耐药基因和毒力基因检测：采用PCR 扩增并检测mecA 基因、erm(A)、erm(B)、erm(C)基因、pvl基因等[3,8]，扩增引物序列见表2。

结 果

一、CA-MRSA 菌株信息

本研究共收集到147 株分离自住院患者标本中的金黄色葡萄球菌菌株，根据头孢西丁纸片法和mecA 基因检测确认，其中共58 株为mecA 基因介导的MRSA 菌株。进一步对这些菌株进行SCCmec分型，筛选出SCCmecⅣ型和Ⅴ型的MRSA 菌株（CA-MRSA 基因型菌株）共9 株，其中SCCmecⅣ型3 株，SCCmecⅤ型6 株。

二、MRSA 的分子特征

采用SPA 分型和MLST，对9 株CA-MRSA 菌株进行分析，共检测到4 种SPA 型别，即t008（1 株）、t034（1 株）、t127（1 株）和t437（6 株）；ST 型别共5 种，包括ST1（1 株）、ST8（1 株）、ST59（5 株）、ST338（1 株）和ST804（1 株）。分子特征分析结果表明，CA-MRSA 中以t437-ST59 克隆为主，每个菌株的具体分子特征信息见表3。

三、CA-MRSA 对非β-内酰胺类抗生素耐药性

采用纸片扩散法检测CA-MRSA 对常用抗生素的敏感性，结果表明，CA-MRSA 对氨基糖甙类、大环内酯类和林可霉素类耐药率高于β-内酰胺类抗生素。9 株CA-MRSA 菌株中有8 株对大环内酯类和林可霉素类耐药，其中有2 株D-试验阳性，为诱导性大环内酯和林可霉素及链阳霉素B 耐药（inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B,iMLSB）表型，携带耐药基因erm(C)，另外6 株D-试验结果为阴性，表现为固有型大环内酯-林可霉素-链阳霉素B 耐药 （constitutive macrolide-lincosamidestreptogramin B,cMLSB），由erm(B)基因介导。此外，有8 株CA-MRSA 菌株对氨基糖苷类抗生素产生耐药，主要对卡那霉素耐药，也有对妥布霉素耐药及庆大霉素耐药的菌株，每株CA-MRSA 具体的耐药情况见表3。

四、CA-MRSA 菌株pvl 基因携带情况

9 株CA-MRSA 菌株中有5 株检测出pvl 基因阳性，主要集中在t437-ST59 克隆（4 株），另外一株分子特征为t437-ST338，表明从这些住院患者标本中分离的CA-MRSA 具有典型的克隆流行特征，且携带pvl 基因。

表2 耐药基因和毒力基因引物

表3 CA-MRSA 菌株的分子特征、耐药情况及毒力基因

讨 论

MRSA 是临床上引起患者感染的重要病原体，由于其大多具有多重耐药性，使得治疗比较困难。近年来的临床数据表明，毒力较强的CA-MRSA 菌株也正逐渐进入医院环境中，引起住院患者的感染[2-3,9]。有研究报道，我国的HA-MRSA 流行克隆为ST239-SCCmecⅢ，CA-MRSA 流行克隆为ST59-SCCmecⅣ、ST59-SCCmecⅤ[1,10]。典型的CA-MRSA 菌株一般仅对β-内酰胺类抗生素耐药，但也有研究发现，随着菌株的进化，CA-MRSA 逐渐开始对非β-内酰胺类抗生素产生耐药，尤其是对大环内酯和林可霉素等耐药[2,9-11]。因此，对CA-MRSA 的耐药性进行检测，具有重要的临床意义。本研究收集分离自住院患者标本的CA-MRSA 菌株，对其分子特征和耐药性进行分析，为进一步监测CA-MRSA 流行及治疗、控制CA-MRSA 感染提供研究依据。

一、CA-MRSA 分子特征和耐药性

本研究共收集到9 例CA-MRSA 菌株，在分子流行病学特征上有5 株为t437-ST59 型，与报道的CA-MRSA 流行克隆一致，表明CA-MRSA 菌株不再局限于社区环境，也进入了医院环境中。2013 年，《公共科学图书馆病原体》杂志上一项数理模型研究[12]预测，CA-MRSA 菌株与HA-MRSA 菌株将会在彼此的环境中共存，认为由于HA-MRSA 菌株具有多重耐药性，使其能在抗生素使用较多的医院环境中流行，而CA-MRSA 菌株的耐药性较低，则在社区流行传播，但随着抗生素的使用、菌株耐药性的改变以及人群结构的变化，CA-MRSA 菌株会与HA-MRSA 菌株在医院环境中同时存在。因此，采用传统的流行病学定义对CA-MRSA 进行区分具有一定的局限性，采用分子特征对MRSA 菌株进行区分可以作为有效的实验室依据。本研究的前期研究显示，鼻腔携带MRSA 菌株在CA-MRSA 传播中具有重要作用[13]，但该结论仍需进一步在大规模样本中进行验证。2011 年的美国传染病学会指南指出，克林霉素、四环素及利奈唑胺等是治疗CA-MRSA 感染的重要药物，而耐药性监测数据表明，欧美地区CA-MRSA 对克林霉素和四环素的耐药率为3%～24%[14]。另外一项来自国内的研究数据表明，我国的CA-MRSA 菌株对克林霉素的耐药率竟高达92%[15]。这表明CA-MRSA 的耐药性日益增加，且呈现对多种非β-内酰胺类抗生素耐药（多重耐药）的趋势。在本研究的9 株CA-MRSA 菌株中，有8 株对红霉素和克林霉素耐药，进一步分析其耐药表型，检测耐药基因后发现，CA-MRSA 中以cMLSB耐药表型为主，主要为erm(B)基因介导，而HA-MRSA 中主要为erm(A)和erm(C)基因介导[13]，提示相对于erm(A)和erm(C)基因，erm(B)基因较小且位于可以水平传播的质粒上，使得这种耐药机制得以在菌株之间广泛传播[15]。结合分子特征与耐药表型及机制可以发现，t437-ST59 克隆主要为erm(B)基因介导的cMLSB耐药表型，其他克隆如t034-ST804、t008-ST8 具有erm(C)基因介导的iMLSB耐药表型，因此在探索耐药机制的同时，对CA-MRSA 菌株的分子特征进行研究，也具有重要意义。

二、pvl 基因表达差异

本研究对与CA-MRSA 密切相关的pvl 基因进行了检测，结果发现9 株CA-MRSA 中有5 株携带pvl 基因，这表明并非所有的CA-MRSA 均携带pvl基因。近来有另一项研究发现，pvl 阴性CA-MRSA引起的感染增加，但从皮肤与软组织中分离的CAMRSA 菌株pvl 基因的携带率仍然较高[16]，这值得进一步探究。虽然有些pvl 基因阳性的CA-MRSA菌株感染可以导致严重的感染性疾病，如坏死性筋膜炎，但pvl 基因在CA-MRSA 感染发病中的作用一直未能被完全确认，临床上观察到pvl 基因阳性CA-MRSA 与pvl 基因阴性CA-MRSA 所引起的感染率间差异无统计学意义[17]，这可能与其他的影响因素（如宿主免疫）有关。

总而言之，本研究对分离自住院患者标本的9 株CA-MRSA 菌株进行了分子特征及耐药性分析，结果发现其中有5 株属于流行克隆t437-ST59-SCCmecⅣ、t437-ST59-SCCmecⅤ；菌株对氨基糖苷类药物（主要为卡那霉素）、红霉素和克林霉素的耐药率较高，表明致病性较强的CA-MRSA 菌株正逐渐进入医疗环境中，同时其对非β-内酰胺类药物的耐药性也逐渐增加，提示临床应加强监控住院患者CA-MRSA 感染。