某院2017-2018年耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌检测及分析

郭 玲，王美玲，叶丽艳，马艳宁，马 薇，宋林键，叶 坤，杨继勇

中国人民解放军总医院第一医学中心检验科，北京 100853

肠杆菌科细菌是引起临床感染的主要病原菌[1]。碳青霉烯类抗菌药物抗菌谱广、抗菌活性强、毒性低，临床上常将其作为严重细菌感染的最佳治疗药物[2]。随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)逐年增多，为临床抗感染治疗带来巨大挑战[3]。CRE是指产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌，对多利培南、厄他培南、亚胺培南或美罗培南耐药[4]。由于CRE传播速度快、致死率高，世界卫生组织将CRE列为21世纪最重要的耐药病原菌之一[5]。

为了解近2年CRE的检出情况，本研究分析了2017-2018年本院临床分离的CRE的分布、药物敏感性特征及携带常见耐药基因情况，以期为医院感染控制和临床抗菌药物的合理使用提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2017-2018年临床分离的肠杆菌科细菌，选择其中对亚胺培南或厄他培南耐药的CRE。

1.2仪器与试剂 VITEK MS质谱仪和VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪及配套试剂均购自法国梅里埃公司。

1.3方法 对CRE进行分离培养；采用VITEK MS质谱仪或VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪进行细菌鉴定；采用VITEK 2 Compact革兰阴性杆菌药敏卡进行药敏试验。采用煮沸法提取待测菌株DNA，进行PCR扩增。将扩增后的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定菌株是否携带目前已知的常见碳青霉烯类耐药基因。部分扩增产物送测序公司进行测序，并将测序结果在GenBank中与标准序列进行比对分析，以确定扩增产物的种类和型别。引物序列来自于文献[6],具体序列见表1。

1.4质量控制 大肠埃希菌ATCC8739、铜绿假单胞菌ATCC27853为药敏试验质控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC1705为blaKPC阳性质控菌株，均购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0软件进行数据处理和分析，计数资料以例数和百分率表示，检出率与耐药率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 常见碳青霉烯酶基因引物序列

2 结 果

2.12017年和2018年不同菌种的CRE检出率比较 本院共分离出肠杆菌科细菌8 006株，CRE检出率为9.3%(745/8 006)，其中2017年CRE检出率为9.6%(383/3 976)，2018年CRE检出率为9.0%(362/4 030)，2017年和2018年阴沟肠杆菌的CRE检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；745株CRE中，肺炎克雷伯菌占81.5%(607/745)，大肠埃希菌占7.2%(54/745)，阴沟肠杆菌占4.0%(30/745)，产酸克雷伯菌占1.5%(11/745)，产气肠杆菌占1.3%(10/745)。其中肺炎克雷伯菌中的CRE检出率达到了24.3%(607/2 495)。见表2。

表2 2017年和2018年不同菌种的CRE检出率比较

2.2CRE的科室分布 745株CRE主要分离自各科的监护室(334/745，44.8%)、外科病区(217/745，29.1%)及内科病区(111/745，14.9%)。其中CRE检出率最高的前5个病区分别为急诊科监护室(79/193，40.9%)、呼吸内科监护室(55/135，40.7%)、神经内科监护室(82/204，40.2%)、呼吸内科病区(72/252，28.6%)和肾病监护室(15/76，19.7%)。见表3。

2.3CRE的来源分布 745株CRE主要来源于呼吸道标本(339/745，45.5%)、引流液(99/745，13.3%)、尿液(89/745，11.9%)、静脉血(65/745，8.7%)、组织(45/745，6.0%)等。CRE检出率最高的标本分别是引流液(99/493，20.1%)、腹水(21/115，18.3%)及呼吸道标本(339/1 867，18.2%)。见表4 。

表3 CRE的科室分布

2.4CRE对常用抗菌药物的耐药率 在临床常用的14种抗菌药物中，CRE对复方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因的耐药率稍低，耐药率分别为42.3%、47.7%和55.4%，对其他抗菌药物的耐药率均>80.0%；不同菌种对抗菌药物的耐药率不同，肺炎克雷伯菌的耐药率相对较高，除复方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因外，对其他抗菌药物的耐药率均>90.0%。见表5。

2.5CRE中碳青霉烯酶基因分布 对CRE进行碳青霉烯酶基因检测和分析，86.3%(643/745)的菌株携带碳青霉烯酶基因，主要为blaKPC(551/745，74.0%)、blaNDM-1(67/745，9.0%)和blaOXA-48(14/745，1.9%)。携带碳青霉烯酶基因的643株CRE中各基因的构成比分别为：blaKPC占85.7%(551/643)、blaNDM-1占10.4%(67/643)、blaIMP占1.9%(12/643)、blaVIM占0.9%(6/643)和blaOXA-48占2.2%(14/643)；含2种及2种以上碳青霉烯酶基因的有7株，检出率为1.1%。肺炎克雷伯菌株中，检出率最高的碳青霉烯酶基因为blaKPC(86.8%，527/607)，而大肠埃希菌和阴沟肠杆菌中，检出率最高的均为blaNDM-1，检出率分别为44.4%(24/54)和33.3%(10/30)。见表6。

表4 CRE的来源分布

表5 CRE对常用抗菌药物的耐药率

续表5 CRE对常用抗菌药物的耐药率

表6 CRE中碳青霉烯酶基因分布(n)

细菌种类混合基因型别blaKPC+blaVIMblaKPC+blaIMPblaKPC+blaNDM-1blaKPC+blaOXA-48肺炎克雷伯菌--31大肠埃希菌----阴沟肠杆菌11--产气肠杆菌----黏质沙雷菌----产酸克雷伯菌-1--摩氏摩根菌----其他肠杆菌属----合计1231

3 讨 论

本研究显示，2017-2018年本院共检出CRE 745株，总检出率为9.3%，与国内平均水平(1.2%～15.5%)基本一致[7-9]；与本院2016年CRE的检出率(6.4%)[10]比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示本院临床CRE检出率呈上升趋势。其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的检出率为24.3%，与2016年比较，也有明显上升趋势，耐碳青霉烯类大肠埃希菌检出率为1.5%，与2008-2016年比较，上升趋势明显[10]。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的流行和传播仍然是导致本院CRE检出率快速上升的主要原因，与国内报道一致[7-9]。有研究指出可以通过合理使用抗菌药物，采集患者的粪便等标本进行CRE主动筛查，防止CRE的传播和流行[7]。英国医疗感染学会联合工作小组2015年11月发布了对多重革兰阴性菌的防控建议，建议高风险人群主动筛查CRE，及早主动筛查CRE并进行干预，能有效降低患者的感染率和病死率[11]。医院目前的防控手段无法有效遏制CRE的传播，因此，进一步明确CRE的传播规律，继续监测CRE的耐药变化，并在此基础上有效防控刻不容缓。

本研究从科室分布分析，本院2年分离到的745株CRE主要分布于各科监护室(44.8%)，其原因可能与监护室患者病情较严重、基础疾病多、住院时间长、免疫抑制剂的广泛应用、抗菌药物使用剂量大、过多涉及侵入性操作等危险因素有关[12]。监护室和呼吸科的患者与其他科室患者比较，较频繁地接受机械性通气和侵入性操作，使原本定植在气道的病原菌侵入并造成感染。因此，临床工作人员应根据患者病情进行评估，尽早让患者脱离呼吸机或采用无创性机械通气，以免增加上述高危科室患者CRE感染机会。

本研究药敏试验结果显示，CRE除对复方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因的耐药率稍低外，对其他抗菌药物的耐药率均>80.0%，说明本院临床分离的CRE耐药状况严重，因此临床如果经验性选用抗菌药物时可首先考虑这3种抗菌药物。但使用阿米卡星需要慎重，有报道显示，应用氨基糖胺类药物治疗CRE感染时，其细菌清除率为88%，高于多黏菌素(64%)和替加环素(43%)，但由于其治疗剂量与中毒剂量接近，不良反应较大[13]。研究发现某些联合用药或者新的酶抑制剂复合药物对CRE的感染治疗有效，但目前还需要大样本的随机对照研究为其提供有力依据[14-15]。应进一步探讨治疗CRE的药物(如替加环素、含酶抑制剂类、多黏菌素、磷霉素等)单药或者联合使用时药敏试验效果，为临床提供参考[16-17]。

在CRE的诸多耐药机制中，最重要的是产碳青霉烯酶。根据Ambler分类法将细菌产生的碳青霉烯酶分为A、B、D三类[18]。本研究中检测的KPC酶属于A类碳青霉烯酶，IMP、VIM及NDM酶属于B类金属酶，OXA-48酶属于D类苯唑西林酶。KPC酶在全世界广泛流行，亚洲地区主要是KPC-2型，是目前研究最多也最常见的一种碳青霉烯酶，主要在肺炎克雷伯菌中检出，在大肠埃希菌、产酸克雷伯菌等也有检出[19]。本研究中blaKPC基因型的检出率为74.0%，其中在肺炎克雷伯菌中占86.8%。在中国ST11型肺炎克雷伯菌是KPC基因的优势菌种，检出率逐年上升，与ST11型KPC菌株的传播及blaKPC基因的传播方式有关。研究发现blaKPC可通过转座子在不同质粒间传播进而在不同菌株间传播[20]，但本研究CRE高检出菌株是否属于ST11型及KPC基因的传播特点仍需要进一步研究。在本研究中，与blaKPC基因型在肺炎克雷伯菌检出率最高不同，blaNDM-1基因型是大肠埃希菌和阴沟肠杆菌等耐碳青霉烯类药物的主要基因型，其检出率分别为44.4%和33.3%。目前产NDM的有1～21个亚型，流行区域不同，进一步明确亚型有助于了解其流行病学特征。除此之外，本研究共检测出7例混合基因型CRE，其中肺炎克雷伯菌4株，阴沟肠杆菌2株，产酸克雷伯菌1株。混合基因型携带的主要基因为blaKPC基因。

综上所述，2017-2018年本院CRE数量和检出率仍然呈上升趋势，CRE对临床常用抗菌药物呈现较高的耐药率。应继续加强院内感染控制，遏制CRE的传播，同时提供可能有效的药物敏感试验结果指导临床用药。