一种利用玉米胚粕与玉米黄浆制作新型培养基发酵生产谷胱甘肽的方法

王允虎，赵晓红，王成忠

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽化合物，在自然界中普遍存在[1]。目前，大多数的谷胱甘肽是以还原型谷胱甘肽存在，氧化型谷胱甘肽较少。谷胱甘肽具有较高的医用价值与食用价值，并且在化工与保健品领域应用甚广[2]。在食品领域，谷胱甘肽对无机盐有增味效果[3]。谷胱甘肽对人体内的氧化还原反应有着极为重要的意义，因其具有消减毒素、抗肿瘤与减缓衰老等作用而备受青睐。目前学者们对谷胱甘肽的研究领域非常广泛，国外对谷胱甘肽的研究主要在生物与检测方面，如Daniela Giustarini等曾研究N-乙酰半胱氨酸乙酯作为谷胱甘肽增强剂在人原发性内皮细胞中的应用，Buchtova Zaneta等的研究利用了电化学检测毛细血管中的谷胱甘肽[4-5]。国内对谷胱甘肽的研究在医学与提取方面较多，就医学方面而言，陈亮等研究了谷胱甘肽对小鼠肝损伤防护的影响，彭春媛等学者研究了谷胱甘肽的合成代谢对早产儿脑损伤的影响[6-7]。就提取方面而言，李双石等研究了乙醇提取法提取葡萄酒废酵母中的谷胱甘肽[8]。但是在提取方面，大多数学者只停留在传统的酵母细胞发酵法以及对此方法的条件优化，运用辅料制备新型酵母细胞培养基发酵生产谷胱甘肽的方法还很少。

玉米胚粕是玉米胚芽经过提油或蛋白后的副产物，因其中纤维含量较高，口感较差，大部分玉米胚粕只是作用于动物饲料方面[9]。玉米黄浆是玉米淀粉加工后的副产物，在加工完淀粉后大多数的玉米黄浆被当作废水处理掉。玉米胚粕与玉米黄浆在发酵生产谷胱甘肽方面有着较好的应用价值，玉米胚粕中碳水化合物的含量可以达到45%～55%，可以为酵母菌提供碳源，玉米黄浆也可以为微生物发酵提供碳源[10]。玉米胚粕与玉米黄浆的优良特性为制作新型发酵生产谷胱甘肽的培养基奠定了基础，从而实现了资源的二次利用，降低了生产成本，有效提高了经济效益。

本研究利用糖化且经过三效浓缩后的玉米胚粕与玉米黄浆混合物为原料，制作了一种新型培养基发酵生产谷胱甘肽。运用单因素试验与正交试验确定培养基配方与最佳发酵工艺条件。采用琥珀酸二酯磺酸钠与异辛烷对谷胱甘肽进行反胶团萃取，经过超滤与低温冷冻干燥后得到谷胱甘肽成品，并求得谷胱甘肽产量，为谷胱甘肽的提取方法提供了理论依据与技术支持。

1 材料仪器与方法

1.1 材料

采用提取蛋白后的玉米胚粕与加工玉米淀粉后的玉米黄浆混合物为原料，酿酒酵母选取S.cerevisiaeL5267，实验药品见表1。

表1 实验药品清单Table 1 The list of experimental drugs

1.2 仪器与设备

MT小型紫铜糖化罐、FR124CN型电子分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；HY-4/5往复式振荡器、SW-CJ-2FD超净工作台、Minimate TF纳滤膜分离设备、Scientz-10ND低温冷冻干燥机。

1.3 数据处理

采用单因素试验与正交试验得到的指标数据，运用Origin与SPSS进行数据对比与分析。

1.4 方法

1.4.1 玉米胚粕与玉米黄浆的浓缩

将玉米胚粕与玉米黄浆经过液化、糖化与三效浓缩提高糖浓度，条件如下：

液化与糖化：将玉米胚粕与玉米黄浆按1∶1混合，调整淀粉浓度在30%～35%之间，利用蒸汽喷射器在0.3～0.5 MPa下进行液化。将液化液转入糖化罐进行糖化，控制糖化酶添加量在90～110 U/g之间。

三效浓缩：一效蒸发温度70～80 ℃，二效蒸发温度65～73 ℃，三效蒸发温度47～55 ℃，出料浓度45%～55%，浓缩后测定DE值大于90。

1.4.2 培养条件优化

分别对DE值、L-cys、KCl和肌醇添加量进行单因素试验与正交试验，研究其对谷胱甘肽合成的影响。

1.4.3 谷胱甘肽提取方法

利用琥珀酸二酯磺酸钠与异辛烷对发酵液进行反胶团萃取，以7 mmol/L Aliquat 366为表面活性剂，调节萃取原料液水相pH为2.5，K+浓度为0.2 mol/L，反胶束与萃取原料液水相的体积比为2∶1，萃取时间为15 min。

萃取完毕后利用NaCl溶液进行反萃取，NaCl为1.3 mol/L，萃取温度为20 ℃，pH为6.1，反萃取完毕后检测萃取液中谷胱甘肽含量，之后将萃取液进行超滤与低温冷冻干燥得到固体谷胱甘肽。

2 结果

2.1 DE值对酵母菌发酵的影响

玉米胚粕与玉米黄浆进行糖化时，通过调节糖化酶的添加量来控制最终浓缩液的DE值，不同的DE 值对S.cerevisiaeL5267酵母菌生长影响见图1。

图1 DE值对酵母菌发酵数量的影响Fig.1 Effect of DE values on fermentation quantity of yeast

由图1可知，DE值在89～92之间时，酵母菌发酵数量随着DE值的增大而增大。DE值为89时，酵母菌发酵后数量为6.15×109CFU/mL。DE值为92时，酵母菌发酵数量达到最大值8.72×109CFU/mL。而进一步将DE值提高到93时，酵母菌发酵数量减少到7.32×109CFU/mL，原因是糖浓度较高时会增强酵母菌的渗透压，导致失水严重，会使其发生质壁分离，从而降低了酵母菌的成活率。因此，当玉米胚粕与玉米黄浆DE值为92时，最有利于酵母菌的繁殖。

2.2 培养基成分单因素试验

2.2.1 L-cys对发酵生产谷胱甘肽的影响

以250 mL液体培养基为准，发酵生产谷胱甘肽时调节L-cys添加量为0.3，0.35，0.4， 0.45，0.5 g，得到发酵液经过反胶团萃取后谷胱甘肽产量，见图2。

图2 L-cys添加量对生产谷胱甘肽的影响Fig.2 Effect of L-cys additive amount on glutathione production

由图2可知，当L-cys添加量为0.4 g时，发酵生产出的谷胱甘肽含量最高，达到了8.218 mg/g。当继续增加L-cys添加量时，谷胱甘肽产量开始降低。添加量为0.5 g时，谷胱甘肽含量降到了7.843 mg/g，产量减少了4.5%。其原因是L-cys作为合成谷胱甘肽的前体物质，合成时需要消耗ATP，当ATP不足时会抑制L-cys的作用，从而降低谷胱甘肽的产量。

2.2.2 肌醇对发酵生产谷胱甘肽的影响

以250 mL液体培养基为准，发酵生产谷胱甘肽时调节肌醇添加量为0.0355，0.0365，0.0375，0.0385，0.0395 g，得到发酵液经过反胶团萃取后，谷胱甘肽产量，见图3。

由图3可知，当肌醇添加量为0.0375 g时，发酵生产出的谷胱甘肽含量最高，达到了8.365 mg/g。当继续增加L-cys添加量时，谷胱甘肽产量开始降低。当肌醇添加量为0.0395 g时，谷胱甘肽产量达到最低7.708 mg/g，产量减少了7.8%。在发酵生产谷胱甘肽时，肌醇在糖类的相互转化中起到重要作用，而且也可以帮助许多活性物质发挥作用。但培养基中添加肌醇过多时会出现析出的现象，从而导致谷胱甘肽的产量有所降低。

图3 肌醇添加量对生产谷胱甘肽的影响Fig.3 Effect of inositol additive amount on glutathione production

2.2.3 K+对发酵生产谷胱甘肽的影响

以250 mL液体培养基为准，发酵生产谷胱甘肽时调节K+浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L，得到发酵液经过反胶团萃取后谷胱甘肽产量，见图4。

图4 K+浓度对生产谷胱甘肽的影响Fig.4 Effect of K+ concentration on glutathione production

由图4可知，当培养基中K+浓度达到0.2 mol/L时，谷胱甘肽含量最高，可达到9.127 mg/g，之后随着K+浓度增加，谷胱甘肽含量随之降低。当K+浓度为0.5 mol/L时，谷胱甘肽生产量达到最低8.579 mol/L，生产量降低了6.0%。K+可以提高酵母细胞的通透性，从而提高其发酵生产谷胱甘肽的效率，但当K+浓度过高时会影响酵母细胞的渗透压，因此降低了谷胱甘肽的生产量[11]。

2.3 正交试验

为确定新型培养基最佳成分配比，对培养基中L-cys、肌醇、K+添加量以及玉米胚粕与玉米黄浆混合物的DE值进行正交试验L9(34)，结果见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

由表3可知，R1>R3>R4>R2，即培养基中各个成分对发酵生产谷胱甘肽的影响顺序为玉米胚粕与玉米黄浆混合物的DE值>肌醇添加量>K+添加量>L-cys添加量。最优发酵条件组合为A2B3C1D2，当玉米胚粕与玉米黄浆混合物的DE值为92，肌醇添加量为0.0370 g，L-cys添加量为0.45 g，K+添加量为0.2 g时，经过琥珀酸二脂磺酸钠萃取后谷胱甘肽生产量最高达到了10.01 mg/g。

表3 正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表4方差分析结果中F比可知，玉米胚粕与玉米黄浆的DE值对发酵生产谷胱甘肽的影响有显著性(F比>F临界值)，其他因素并没有达到显著水平

表4 方差分析结果Table 4 The results of variance analysis

3 讨论

研究可知，新型培养基配比为L-cys 0.4 g、肌醇 0.0375 g、K+0.2 mol/L、玉米胚粕与玉米黄浆糖化液100 g(DE值92)、蒸馏水150 g。在此条件下，谷胱甘肽产量达到10.01 mg/g。

通过研究新型培养基的成分配比可知，玉米胚粕与玉米黄浆的DE值是决定发酵生产谷胱甘肽产量的主要因素。适当DE值可以为酵母菌提供充足的ATP以及维持适当的渗透压，为酵母菌提供良好的发酵环境，可作为培养基的优良碳源。而L-cys、肌醇与K+则辅助酵母菌发酵生产，优化其发酵生产环境，影响效果要低于玉米胚粕与玉米黄浆[12]。

与常见发酵方法相比，将玉米胚粕与玉米黄浆作为碳源制作发酵生产谷胱甘肽的培养基具有较高的生产效率。普通酵母菌培养基发酵生产谷胱甘肽产量大约在7.83 mg/g，而本研究谷胱甘肽产量达到了10.01 mg/g[13]。玉米胚粕与玉米黄浆价格低廉，可降低谷胱甘肽的生产成本，并且使得玉米胚粕废料得到了二次利用。我国是玉米与小麦的种植大国，且玉米胚中含有丰富的谷胱甘肽，将其用作原材料发酵生产谷胱甘肽有着重要的社会价值与经济效益[14]。