NLRP3炎性小体在创伤性脑损伤中的作用

2021-04-16 01:32阎朝龙闫惠颖综述伟审校
医学研究生学报 2021年4期
关键词:外排溶酶体小体

阎朝龙,闫惠颖综述,金 伟审校

0 引 言

创伤性脑损伤 (traumatic brain injury, TBI) 是战争时期及现代社会生活中一种常见的外伤类型,死亡率及致残率居各种外伤之首,随着城市化的进程,TBI的发生率逐年上升,在全球每年可造成约4000亿美元的经济负担[1]。TBI的病理过程包括原发的机械性损伤及多种因素导致的继发性损伤两个阶段。其中原发性损伤指出血和神经元丢失等,发生在创伤当时,无法进行临床干预;继发性损伤主要包括神经炎症、氧化应激、钙超载、代谢毒物产生和神经元凋亡等,在损伤发生后的病程中持续进展性发生,因此抑制或减缓TBI后继发性损伤的持续发展对改善TBI患者的预后有着重要意义[2-3]。

神经炎症反应是机体先天免疫系统的重要组成部分,在TBI、蛛网膜下腔出血等中枢神经系统疾病的病理过程中发挥重要作用。适度炎症反应的发生,可以促进组织损伤后细胞碎片的清除和加速损伤神经元的修复,但是过度的炎症反应,同样也会加重细胞损伤和导致疾病的恶化[4]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3) 炎性小体在TBI后的炎症反应及多种继发性损伤中发挥着重要作用[5]。本文就TBI后NLRP3炎性小体的激活以及针对NLRP3炎性小体激活的治疗措施的研究进展进行综述,为缓解TBI后继发性损伤及改善病人预后的临床前和临床研究提供参考。

1 NLRP3炎性小体

核苷酸结合寡聚化结构域样受体 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor, NLRs) 是模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRRs) 家族的一个亚类,在机体的先天免疫系统发挥重要的调节作用。NLRP3正是NLRs家族中研究最为广泛的一员,在神经元细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、血管平滑肌细胞等细胞中广泛多样性表达,在TBI、阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈病、缺血性脑卒中等中枢神经系统疾病的发病机制中发挥重要作用[6]。

1.1NLRP3炎性小体的分子组成NLRP3炎性小体是一种多蛋白聚合复合物,由感受器分子NLRP3、衔接蛋白ASC (apoptosis associated speckle-like protein containing CARD) 和效应蛋白前体pro-caspase-1 3个部分组成,见图1。其中,NLRP3包含C端的亮氨酸重复序列LRR (leucine rich repeat)、中段特征性的核苷酸寡聚化结构域NACHT (nucleotide-binding and oligomerization domain,NOD/NACHT)和N端的效应结构域PYD (pyrin domain) 三个部分;ASC蛋白包含一个PYD结构域和一个CARD (caspase activation and recruitment domain) 结构域;pro-caspase-1也包含一个CARD结构域。炎性小体受到刺激激活时,NLRP3通过PYD结构域与ASC相互连结,进而通过ASC的CARD结构域招募pro-caspase-1形成NLRP3-ASC-pro-caspase-1复合物,对pro-caspase-1进行剪切产生有活性的caspase-1[7]。

活化的caspase-1可以将下游无活性的白细胞介素 (interleukin,IL) -1β前体和IL-18前体转化成有活性的、分泌形式的IL-1β和IL-18,活化的炎症因子将启动并放大下游的炎症信号通路,发生严重的炎症反应。此外,激活的caspase-1还可以剪切细胞焦亡的效应蛋白GSDMD (Gasdermin-D),剪切产生的N末端产物GSDMD-N能够介导细胞膜上膜孔的形成,增加细胞内外液体的流动,导致细胞的肿胀和破裂,在细胞焦亡中起关键作用[8]。

图 1 NLRP3炎性小体的组成及激活示意图

1.2NLRP3炎性小体的激活研究表明,NLRP3炎性小体的激活需要启动和激活两个信号。在静息状态下,细胞内的NLRP3处于低表达水平,不会进行炎性小体的组装和激活;但是微生物分子 (如Toll样受体配体) 或内源性细胞因子 (如肿瘤坏死因子α) 等对NF-κB的激活,可以在转录水平增加NLRP3和pro-IL-1β的表达,这是炎性小体的启动信号。此外,最新的研究认为,启动信号也可以在转录后水平上调炎性小体的激活[9]。第二步的激活信号主要调控炎性小体的组装过程。NLRP3炎性小体可以被一系列损伤相关分子模式 (如二氧化硅、细胞外ATP和尼日利亚菌素等)和病原相关分子模式 (如微生物造孔毒素等)触发组装激活,但是鉴于激活剂数量和结构的多样性,NLRP3不太可能与所有的激活剂直接相互作用,而是感知这些激活剂引起的细胞内信号[9]。目前,已提出的可以解释NLRP3炎性小体激活的细胞内信号主要分为三类:钾离子的外排、活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的产生和溶酶体的破裂[7]。

1.2.1钾离子的外排细胞内外离子的流动被认为是NLRP3炎性小体的激活因素,包括K+的外排、Cl-的流出以及钙信号的改变等。其中,K+外排是目前公认的NLRP3炎性小体激活的上游信号事件[10]。一方面,在ATP、尼日利亚菌素、结晶和颗粒分子、双链DNA等多种NLRP3激活剂对炎性小体的激活事件中观察到了细胞内K+浓度的降低。另一方面,多种刺激对NLRP3炎性小体的激活也可以被细胞外高浓度的钾 (30~45mol/L) 所抑制[10]。例如:细胞外高浓度的ATP分子通过激活P2X嘌呤受体7降低细胞内K+浓度进而激活NLRP3炎性小体[11];尼日利亚菌素作为离子载体,诱导细胞膜两侧K+/H+的交换导致细胞内K+外排而诱导NLRP3炎性小体的激活[12]。而且,使用钾离子通道抑制剂格列苯脲可以有效抑制多种激活剂对炎性小体的激活,也从另一个角度阐述了K+外排在炎性小体激活中的重要作用[13]。此外,包括咪喹莫特和CL097在内的一些小分子,可以诱导ROS的产生,以一种不依赖K+外排的方式,促进炎性小体的激活[14]。这些结果表明,K+外排对于NLRP3炎性小体的激活非常重要,但又不是必须的、唯一的因素。

尽管细胞内K+的减少可以激活NLRP3炎性小体是明确的,但是K+的浓度如何调控NLRP3的激活依然未知。有两个研究分别发现,K+的外排对于NLRP3炎性小体组装的一个关键步骤即NIMA相关激酶7 (never in mitosis A (NIMA)-related kinase 7) 与NLRP3的结合是必要的[15-16]。总的来说,这些研究支持K+外排作为NLRP3炎性小体激活的远端上游信号,并且可能是通过影响NLRP3-NEK7的相互作用或者促进线粒体ROS产生实现的。

1.2.2ROS的产生ROS的产生,特别是线粒体来源的ROS,是最早被认为触发炎性小体激活的因素之一[17]。多项研究表明,NLRP3炎性小体的激活剂 (如ATP、二氧化硅、尼日利亚菌素等) 可以诱导细胞内线粒体ROS的产生,并且ROS清除剂的使用会阻断激活剂对NLRP3的激活[14]。这种ROS的产生通常伴随着K+的外排,但是K+外排和ROS产生之间的确切机制尚不清楚。而且,ROS的产生如何导致NLRP3炎性小体的激活,依然没有确切的解释。一些研究提供了潜在的见解:NLRP3激动剂可以以ROS依赖性方式触发NLRP3与硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)的相互作用。静息状态下,TXNIP与硫氧还蛋白组成性结合并受其抑制;细胞ROS浓度的增加,使得该复合物解离,TXNIP与NLRP3结合,导致NLRP3炎性小体的活化。但是,在没有TXNIP的情况下,caspase-1的活化和IL-1β的分泌并未被完全抑制,表明仍然有其他机制的存在[18]。有最新的研究表明,线粒体ROS的产生,导致线粒体的损伤,进而会引起线粒体DNA (mtDNA)合成、氧化的增加,氧化的mtDNA能够与NLRP3炎性小体缔合导致炎性小体的激活[19]。也有研究从感知ROS的层面解释,是NEK7而不是NLRP3本身能够感知ROS的产生,因为咪喹莫特诱导的ROS依赖性的NLRP3炎性小体的活化在NEK7缺陷的细胞中消失了[14]。因此,ROS的产生触发炎性小体激活的具体机制,依然众说纷纭,值得更加深入的研究。

此外,ROS的产生对NLRP3炎性小体的激活的确非常重要,但也不是绝对必要条件,线粒体ROS非依赖性炎性小体的激活也已有报道[20]。

1.2.3溶酶体的破裂二氧化硅、明矾等颗粒性活化剂清除效率的降低会导致溶酶体的破裂和溶酶体内物质的释放,触发NLRP3炎性小体的激活。有研究表明溶酶体的破裂不仅参与了炎性小体的激活步骤,而且参与了启动步骤。在棕榈酸盐诱导的NLRP3炎性小体激活中,一方面溶酶体钙信号通过稳定IL-1β的mRNA调节IL-1β前体的生成 (启动信号),另一方面溶酶体破裂释放的组织蛋白酶B促进了NLRP3炎性小体的激活(激活信号)[21]。也有一项研究进一步证实了多种组织蛋白酶可以促进NLRP3炎性小体的激活,而且使用组织蛋白酶B的抑制剂CA-074-Me可以抑制NLRP3炎性小体的活化[22]。但是,组织蛋白酶B抑制剂在发挥作用时也有可能由于脱靶效应或者靶向组织蛋白酶家族的其他成员而被干扰。颗粒物质除了通过吞噬作用导致溶酶体的破裂,还会触发吞噬作用依赖性的K+外排,进而激活NLRP3炎性小体[23]。然而,将颗粒物诱导的溶酶体破裂和K+外排联系起来的机制尚待深入研究。此外,TAK1-JNK途径 (TAK1:transforming growth factor beta-activated kinase 1,转化生长因子活化蛋白激酶1;JNK:c-Jun N-terminal kinase,N末端激酶) 最近也被报道在溶酶体破坏后激活,并在NLRP3炎性小体活化中发挥作用[24]。因此,溶酶体破裂在NLRP3炎性小体活化中发挥着重要作用,触发活化的详细机制仍需要进一步研究。

总而言之,NLRP3的激活剂通过触发包括钾离子外排,线粒体功能障碍和溶酶体破裂在内的多种细胞和分子事件,在炎性小体的激活中发挥了重要作用,特别是细胞内离子水平的改变,把不同的信号转导联系起来;但是各激活信号激活炎性小体的详细机制依然值得更深入的研究。

2 创伤性脑损伤中NLRP3炎性小体的激活

Liu等[25]进行了第一个TBI中NLRP3炎性小体表达的研究,作者发现在中度TBI (改良的自由落体打击模型)后的第一周内,大鼠皮层脑组织中NLRP3相关基因和蛋白表达显著上升。 具体来说,炎性小体的引发信号 (即NLRP3、ASC和pro-caspase-1的mRNA和蛋白)和激活信号 (caspase-1 p10、IL-1β和IL-18的蛋白) 在脑损伤后6h被上调,并一直到损伤后7d的实验终点时都处于上调水平[25]。自首次发表以来,已有大量研究支持NLRP3炎性小体的基因和蛋白表达在TBI动物模型中上调[26-27]。而且,Irrera等[28]通过使用NLRP3-/-基因型小鼠和NLRP3抑制剂BAY 11-7082药物处理两种方式与野生型小鼠形成对比,在TBI后第7天观察到小鼠在行为学和组织学损伤上明显减弱。在TBI后NLRP3炎性小体激活的机制研究上,Chen等[29]通过使用NEK7-shRNA病毒,发现敲低NEK7可以改善TBI小鼠 (控制皮层损伤模型) 的神经功能损伤和减弱NLRP3炎性小体的激活,表明NEK7可能是调节TBI后NLRP3激活的潜在靶点。而Ma等[30]则是从ROS的角度发现,通过基因敲除NOX2,可以降低TBI后的ROS水平,进而影响TXNIP与NLRP3的相互作用,调节NLRP3的激活,减少TBI后脑组织的炎性损伤。这些结果的发现,为TBI后NLRP3炎性小体的激活提供了重要证据;但是TBI诱导的NLRP3炎性小体激活的具体机制依然值得深入研究,特别是溶酶体破裂是否在TBI后NLRP3炎性小体的激活中发挥作用还是一片空白。

然而,关于TBI后NLRP3炎性小体激活的临床研究依然较少。在Lin等[31]的研究中,与癫痫患者相比,在重度TBI患者切除的皮层组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达显著上调。另一项临床研究分析了重度颅脑损伤的婴儿和儿童患者 (0~24岁) 的脑脊液中NLRP3的蛋白含量,发现TBI患者脑脊液中NLRP3的含量显著高于同年龄的对照组;而且根据患者TBI后6个月的格拉斯哥评分判断,脑脊液中NLRP3浓度>6.63 mg/mL与神经系统不良预后独立相关[32]。这项研究首次证明了NLRP3作为基于体液的脑外伤预后生物标志物的潜在效用,但是NLRP3在更大范围的年龄人群以及人体的外周循环血液中是否具有可能的生物学标志物依然值得研究。

3 NLRP3炎性小体作为TBI治疗的靶点

随着对NLRP3炎性小体在创伤性脑损伤中激活机制的研究,以NLRP3炎性小体为靶点来改善TBI预后的研究也逐渐增多。特别是NLRP3-/-的基因小鼠已经显示出减少TBI后组织学损伤和改善神经功能的结果[28],更是推动了靶向NLRP3炎性小体来减弱TBI后继发性脑损伤和改善TBI远期预后的研究。目前,已有多种药物或治疗措施通过直接或间接抑制TBI后NLRP3炎性小体的活性在临床前研究中显示出了治疗潜力,这些治疗方法主要分为以下五类:①靶向NLRP3分子的抑制剂 (例如MCC950、JC-124等[26-27, 33-34]);②靶向NLRP3炎性小体组成分子的抑制剂 (例如抗ASC抗体、caspase-1选择性抑制剂VX765等[35-36]);③NLRP3炎性小体激活的上游信号分子的抑制剂 (例如右美托嘧啶、NF-κB抑制剂等[37-38]);④其他机制未明的非特异性抑制剂:包括部分经典药物的新用法 (例如异丙酚、替米沙坦等) 和一些天然化合物 (例如ω-3脂肪酸、芒果苷等)[39-42]; ⑤物理治疗 (例如高压氧治疗) 等其他方法[43]。下表汇总了目前能够抑制TBI后NLRP3炎性小体激活的治疗措施。

MCC950是一种有效的、高度选择性的NLRP3抑制剂,可以与NLRP3的NACHT域直接相互作用,从而阻止ATP水解并抑制NLRP3的活化和炎性体的形成[48]。大量的临床前研究证实,MCC950具有良好的中枢神经系统渗透性,而且对NLRP3的高选择性使其不会脱靶与NLRP1或NLRC4炎性小体结合,具有良好的应用前景[48-49]。系统性注射MCC950也在脑出血和阿尔兹海默症等中枢神经系统疾病的临床前研究中显示了良好的结果[50-51],最近的两项研究也展示了MCC950在TBI中的应用前景[26, 34]。Ismael等[34]通过给TBI小鼠腹腔注射MCC950,发现小鼠皮层组织中NLRP3炎性小体组分 (NLRP3, caspase-1, ASC, and IL-1β) 在TBI的急性期 (24 h) 的表达显著降低,并且caspase-1和IL-1β的减少持续到亚急性期 (72 h);而且,伴随NLRP3炎性小体激活的抑制,小鼠的神经功能评价 (mNSS评分)在观察期72 h内也得到显著改善。而Xu等[26]在观察到NLRP3炎性小体表达降低的同时,发现腹腔注射MCC950对TBI小鼠神经功能的改善可以延长到14 d,这为MCC950在脑损伤中应用的安全性、有效性提供了更长的观察期限。此外,Xu等[26]的研究还发现小胶质细胞是TBI后NLRP3表达增加的主要来源,MCC950可以同时抑制小胶质细胞的激活和NLRP3的表达;而且发现通过药物清除TBI后的小胶质细胞使得MCC950神经保护及减轻水肿的作用被消除,证明小胶质细胞的存在对MCC950发挥保护作用有重要价值[26]。综上所述,MCC950在小鼠TBI的急性期和亚急性期显示出了一定的神经保护效果,但是针对于MCC950在TBI后的治疗窗和该化合物在其他种属的TBI中是否具有疗效还需更多的研究。

JC-124是通过对格列苯脲的结构进行优化设计后得到的NLRP3特异性抑制剂,它可以有效抑制由ATP诱导的NLRP3炎性小体的激活。JC-124可以特异性抑制NLRP3炎性小体的激活信号而不影响NF-κB信号相关的启动信号或者其他炎性小体的激活信号,因此具有NLRP3选择性[27]。与格列苯脲相比,JC-124消除了格列苯脲产生低血糖症的风险,具有更高的安全性;与MCC950相比,JC-124可能在K+外排的下游或者通过抑制ATP酶的活性发挥抑制作用而MCC950不影响ATP诱导的Ca2+通量,因此他们发挥作用的机制不同[13, 49]。在Kuwar等[27]的研究中,与对照组相比,JC-124处理显著降低了NLRP3炎性小体在TBI后48h大鼠脑组织中的表达;但是该团队并未进行神经功能相关的行为学方面的检测。有趣的是,在Kuwar的研究中,无论是TBI损伤还是JC-124处理,都没有对IL-18的表达水平产生显著的差异性影响,这可能与其他课题组观察到的IL-1β和IL-18的差异性表达模式相关[25, 27]。因此,作为NLRP3的特异性抑制剂,JC-124还需要更多的研究来探明其在抑制NLRP3时的详细机制以及其在TBI后神经功能方面是否具有同样的保护作用。

与MCC950和JC-124相比,其他治疗措施虽然也被证明通过抑制NLRP3炎性小体的活性改善了实验性脑损伤的预后,但是尚未有证据显示这种改善作用呈NLRP3依赖性,因此很难判断预后的改善是否靶向NLRP3炎性小体或者是否还有NLRP3炎性小体以外的机制也影响了预后的变化。所以,综合以上治疗措施的研究,MCC950和JC-124作为NLRP3的特异性抑制剂,最有可能揭示NLRP3炎性小体在TBI中的确切机制并有希望成为改善TBI预后的治疗选择。

4 总结与展望

创伤性脑损伤是全球范围面临的,具有极高致死率和致残率的健康卫生问题。目前已有一些临床前研究和临床研究显示NLRP3炎性小体在TBI后被上调,并在TBI后的继发性损伤中发挥重要作用。此外,也有一些NLRP3炎性小体相关的抑制剂在临床前研究中显示出抗炎作用并改善TBI的神经功能预后。更重要的是,在最新的临床研究中,体液中的NLRP3及相关分子显示出了作为神经炎症的生物标记物的潜力。但是,有关NLRP3及相关分子在TBI病人体内具有怎样的变化规律,以及临床前研究中的阳性治疗措施是否能够实现临床转化,依然需要更多的研究。

猜你喜欢
外排溶酶体小体
炎性小体与缺血性脑卒中发病及中医相关机制的研究进展
NLRP3炎性小体在中枢神经系统疾病中的作用研究进展
多粘菌素外排转运蛋白的研究进展
胆管癌患者组织中NLRP3炎性小体的表达水平与其临床病理特征及预后的关系
异常早幼粒细胞Auer小体发生率的影响因素分析
溶酶体酸性环境促进猪血凝性脑脊髓炎病毒的复制
大连化物所发展出时空超分辨四维荧光成像 解析全细胞溶酶体
大肠埃希菌主动外排泵的研究进展
浅谈溶酶体具有高度稳定性的原因
三排式吻合器中的双吻合钉推进器对