枇杷叶总黄酮的水提工艺研究

王增斌,宋 雪,庞同汇,包俊文,于 丹,鲁周民

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

枇杷(Eriobotryajaponica)是蔷薇科枇杷属常绿植物，因果实形状似琵琶而得名，栽培历史悠久，种质资源丰富[1]。中国是枇杷的原产地，也是世界上最主要的枇杷生产国，产量约占世界枇杷总产量的70%[2]。枇杷属于亚热带常绿小乔木，国内主要分布在福建、江苏、浙江、湖北、四川、云南、安徽以及陕南等地[3]，国外分布于西班牙、意大利、土耳其、巴西以及日本、巴基斯坦等东南亚国家[4]。枇杷叶别名巴叶、芦桔叶，是传统中药材，其性微寒，味苦辛，具有止咳清肺、降逆止呕的功效，多用于肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆和烦热口渴等治疗[5]。枇杷叶中含有多种化学成分，主要包括多酚类、黄酮类、三萜酸类、倍半萜类、挥发油、糖苷类等[6]。其中，黄酮类化合物亦称为黄碱素、黄酮体和类黄酮，广泛存在于自然界中，数量众多，可列为天然酚类化合物之首[7]。相关研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤[8]、抗炎[9]、抗肾衰竭[10]、抗氧化[11]、降血糖[12]、自由基清除[13]的能力，应用前景广泛。

近年来，有关植物功能成分的提取研究日益增多，提取技术也在不断创新，包括水提法、醇提法等传统提取技术以及超声、微波等新型辅助提取技术。研究表明，生枇杷叶和炙枇杷叶水提物的止咳化痰平喘效果明显优于醇提物[14]。枇杷生长叶水提物中含有较高的黄酮类化合物，比醇提物具有更强的止咳作用；而落叶醇提物含有较高的三萜酸类物质，祛痰效果更好[15]。目前，枇杷叶水提物研究文献，大多是在单一固定条件下进行提取，而有关在超声辅助条件下，对提取条件进行优化的研究还鲜有报道。本文以枇杷枝条下部成熟叶片为试验材料，比较系统地对枇杷叶总黄酮的水提工艺进行正交优化研究，旨在为枇杷叶的进一步开发应用提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 2019年4月于西北农林科技大学南校区枇杷园，选取枇杷树冠四周成熟枝条下部叶片。

1.1.2 试剂 芦丁标准品、蒸馏水、无水乙醇、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠(购自广东光华科技股份有限公司)；以上药品均为分析纯。

1.1.3 仪器 万分之一分析天平、便携式电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、粉碎机、数控超声波清洗器、台式高速离心机、紫外—可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 将采摘的枇杷叶刷去绒毛，清洗干净，放入托盘，置于烘箱中60 ℃干燥至绝干。待冷却至室温后粉碎，过40目筛。按试验设计，准确称取枇杷叶粉末0.50 g，置于50 mL离心管中，加入蒸馏水，浸泡30 min后进行超声提取。12 000×g离心10 min，取上清液0.4 mL用于总黄酮提取率测定[16-17]。

1.2.2 单因素试验

(1)料液比对总黄酮提取率影响试验

精确称取0.50 g枇杷叶粉末6份，分别置于50 mL离心管中，按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸馏水，浸泡30 min；在温度30 ℃，超声波功率100 W下提取30 min，研究料液比对总黄酮提取率的影响[18]。

(2)提取温度对总黄酮提取率影响试验

精确称取0.50 g枇杷叶粉末6份，分别置于50 mL离心管中，按照料液比1∶20加入10 mL蒸馏水，浸泡30 min；改变提取温度，分别为30、35、40、45、50、55 ℃，在超声波功率100 W下提取30 min。研究提取温度对总黄酮提取率的影响。

(3)提取时间对总黄酮提取率影响试验

精确称取0.50 g枇杷叶粉末6份，分别置于50 mL离心管中，按照料液比1∶20加入10 mL蒸馏水，浸泡30 min；在提取温度50 ℃，超声波功率100 W下，分别提取10、20、30、40、50、60 min。研究提取时间对总黄酮提取率的影响。

(4)超声波功率对总黄酮提取率影响试验

精确称取0.50 g枇杷叶粉末6份，分别置于50 mL离心管中，按照料液比1∶20加入10mL蒸馏水，浸泡30 min；在提取温度50 ℃下，改变超声波功率，分别为50、60、70、80、90、100 W，提取30 min。研究超声波功率对总黄酮提取率的影响。

1.2.3 正交试验 在单因素试验的基础上，固定料液比为1∶20，对提取温度、提取时间和超声波功率三因素采用L9(34)正交表进行试验设计[19]，对枇杷叶总黄酮的提取工艺进行正交设计，试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3 指标测定方法

1.4 数据处理方法

采用SPSS 25.0和Excel 2010软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对总黄酮提取率的影响 从不同料液比条件下，枇杷叶总黄酮提取效果图(图1)可以看出，在试验条件下，随着料液比的增大，总黄酮提取率先升高，在料液比为1∶20时枇杷叶中总黄酮提取率最高，为3.20%，之后随着料液比的增大，总黄酮提取率逐渐降低。

图1 料液比对枇杷叶总黄酮提取率的影响

2.1.2 提取温度对总黄酮提取率的影响 从不同提取温度条件下的枇杷叶总黄酮提取效果图(图2)可看出，在试验条件下，随着温度的升高，总黄酮提取率逐渐增加，并在50 ℃处达到最大值，为3.80%，可能是由于温度升高导致分子运动加快，细胞透性增加，使得更多的黄酮类化合物从细胞中溶解出来。当温度高于50 ℃时，随着温度的升高，总黄酮提取率下降，可能是由于温度过高可能会使得某些黄酮类化合物分解。

图2 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.1.3 提取时间对总黄酮提取率的影响结果 不同提取时间条件下的枇杷叶总黄酮提取效果见图3。可以看出，在试验条件下，随着提取时间的增加，总黄酮提取率先升高，在30 min时达到最大值(3.80%)，升高的原因可能是由于黄酮类化合物的溶出需要一定的时间，时间增加使得溶出充分。随着时间的延长，总黄酮提取率逐渐下降，分析原因可能是在空气中暴露的时间过长，黄酮类化合物有效成分分解。

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.1.4 超声波功率对总黄酮提取率的影响 不同超声波功率条件下的枇杷叶总黄酮提取率变化如图4，可以看出，在试验条件下，随着超声波功率的增加，总黄酮提取率也逐渐升高，超声波功率为100 W时的总黄酮提取率最高，为3.75%。分析原因可能是是超声波频率的增加会增大细胞的破碎程度，使得更多的黄酮类化合物溶解出。

图4 超声波功率对总黄酮提取率的影响

2.2 正交优化结果

从正交优化试验结果(表2)及其极差分析，和以总黄酮提取率为纵坐标、因素为横坐标制作的影响因素与总黄酮提取率关系图[22](图5)可以看出，当提取温度增加时，总黄酮提取率也逐渐升高；当提取时间增加时，总黄酮提取率也逐渐升高；当超声波功率增加时，总黄酮提取率先升高后降低。该试验条件下对总黄酮提取率影响程度的大小顺序依次为：提取温度>超声波功率>提取时间。三种因素的最优组合为A3B3C2，即提取温度55 ℃、提取时间40 min、超声波功率90 W。在此条件下，总黄酮提取率达到了4.00%，经过三次验证试验，平均总黄酮提取率为4.18%。通过对正交试验进行方差分析(表3)，其结果与极差分析一致。

表2 正交优化试验结果

图5 各因素与总黄酮提取率的关系

3 结论

在料液比1∶20的情况下，确定了提取温度、提取时间和超声波功率这三个因素对于枇杷叶总黄酮提取率大小的影响程度：提取温度>超声波功率>提取时间。通过正交优化试验设计，最终确定了枇杷叶黄酮类化合物超声辅助水提最佳工艺：提取温度为55 ℃，提取时间为40 min，超声波功率为90 W，其总黄酮提取率在此条件下达到了4.18%，可以应用于枇杷叶黄酮类化合物的生产。

表3 正交试验方差分析表