人腺病毒疫苗的研究进展

席华龙，顾韩雪 综述，孙博，谷铁军 审校

1.长春百克生物科技股份公司，吉林长春130012；2.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）于 1953 年被Rowe 从腺样组织中分离出来，是一种无包膜的双链 DNA 病毒［1］。病毒直径 70 ～ 100 nm，衣壳呈二十面体对称结构，由240 个六邻体（hexon）和12个五邻体组成，每个五邻体上均外有纤突（fiber）［2］。大部分腺病毒（adenovirus，AdV）通过科萨奇腺病毒CAR 受体介导感染，少部分AdV 使用膜辅助因子CD46 和 ／ 或桥粒芯糖蛋白 2（desmoglein 2，DSG2）作为受体［3-5］。目前已经发现的 HAdV 共 7 种（A ～ G），分为60 多种血清型。早期对HAdV 鉴定、表征和分类主要依赖于血清中和（serum neutralization，SN）和血凝抑制的方法，目前则主要通过基因组学和生物信息学方法对整个病毒基因组进行分析，来对新的病毒分型［6-8］。HAdV 可通过多种途径感染引发多种疾病，如腺病毒F 和G 种引发的肠胃炎，腺病毒B、C 和E 种引发的呼吸道疾病，腺病毒C 种引发的肝炎，腺病毒A、B 和D 种引发的脑膜炎，腺病毒B 种引发的膀胱炎，腺病毒B 和D 种引发的角膜炎和结膜炎等［2，9］。其中，尤以在儿童和军队中引发的急性呼吸道疾病较为严重，且无有效的治疗药物，主动免疫成为唯一有效的预防手段［10-11］。本文对HAdV 疫苗的研发和应用作一介绍，以期有助于推进国内HAdV疫苗的研究。

1 HAdV 灭活疫苗

第一种HAdV 疫苗产品诞生于美国，为福尔马林灭活疫苗，包含4 型和7 型两个型别［12］。将RI-67（HAdV4）和 RI-4-202（HAdV7）分别经人气管上皮细胞和人羊膜上皮细胞分离，最终适应至原代猴肾上皮细胞。病毒感染4 ～7 d 后，收获培养物进行均质处理，经离心、过滤获得病毒悬液，病毒悬液被抗血清中和后通过多种途径注射仓鼠、乳鼠、成年小鼠、兔、豚鼠和恒河猴等动物，进行一系列安全性检测，未检测到外源微生物。病毒悬液经福尔马林水浴36 ℃灭活6 d，用Hanks 缓冲液4 ℃透析去除灭活剂后，制备的灭活疫苗首先接种肾上皮细胞培养12 d，然后将细胞培养物接种猴肾细胞进一步培养12 d，无细胞病变确认灭活完全。由于病毒的种属特异性，灭活疫苗免疫豚鼠并未激起有效的免疫应答。在人体试验中，12 名志愿者于肱三头肌注射1 mL 灭活疫苗，对其中5 名志愿者免疫前后的血清中和抗体进行检测，结果表明，每位志愿者不仅产生了4 型和7 型病毒中和抗体，对3 型病毒也产生了一定的交叉保护，但第2 针注射并未引起免疫增强效果［13-14］。在美国迪克斯堡新兵训练营开展的Ⅰ期临床试验中，311 名士兵接种HAdV 灭活疫苗1 周后，仅有4.8%因呼吸道疾病住院治疗，而安慰剂组312 名士兵因呼吸道疾病住院治疗占23.8%，双价灭活疫苗显著降低了急性呼吸道疾病的发病率；在随后的大型临床试验中，来自245 个连队的约14 000 士兵接种了HAdV灭活疫苗，但因人员训练和调离等，仅对其中8 238人完成了临床跟踪，结果显示，双价灭活疫苗能将HAdV 引起的急性呼吸道疾病降低90%，进一步表明了疫苗商业化生产的可行性［15］。增加3 型后的3价灭活疫苗的应用分析报告指出，3 价疫苗将发热性呼吸道疾病的总发病率降低了55%，疾病导致的住院治疗减少了65%，尽管保护率下降，但据估算当年约为美军节省了500 万美元的开支，对新兵急性呼吸系统疾病的控制具有有重要价值［16-17］。但之后的研究发现，制备疫苗的毒种被SV40 病毒污染，该病毒在哺乳期仓鼠与人类组织培养的细胞中诱导肿瘤转化，且SV40 病毒基因组的一部分可整合至7 型腺病毒基因组中形成杂交病毒，具有潜在的致癌作用，随后该HAdV 灭活疫苗退出市场［18-19］。

2 HAdV 减毒活疫苗与口服活疫苗

由于猴肾细胞灭活疫苗的安全性问题以及猴的供应短缺，科研人员使用更为安全且廉价的细胞来取代猴肾细胞［20］。取自猪的肾细胞在1 ～7 型HAdV感染7 ～14 d 后，产生类似于猴肾细胞或HeLa 细胞的病变效应［21］。将7 型和4 型HAdV 分别在猴肾细胞上连续传代17 代，再在猪肾细胞上传代17 代，得到减毒的7 型和4 型HAdV。数名志愿者鼻腔滴入减毒后的病毒后，在7 型接种组，无志愿者发生类似感冒的感染症状，仅1 名接种150 000 TCID50病毒的志愿者因不适卧床1 日。初步观察表明，1 500 TCID50以上剂量能诱导较高的中和抗体，但抗体水平在6个月内下降了约2 倍。同时，接种组产生的中和抗体还对3 型HAdV 具有良好的交叉保护。5 名志愿者接种了减毒4 型HAdV，在咽喉部均未检测到病毒。接种低剂量250 TCID50的3 名志愿者未产生相应的中和抗体，而接种高剂量2 500 TCID50的2 名志愿者产生相应的中和抗体，但均伴随轻微的喉咙疼痛［22］。由于未进行传代稳定性研究，猪肾减毒的病毒株是否能回复毒力而在人群中造成感染，导致疾病流行仍是未知。

SV40 的污染以及病毒较低的生产效率促使科研人员在其他方向进行HAdV 疫苗的设计开发。通过一系列的研究发现，HAdV 易感染下肠道，因此研发了新的免疫方法。将4 型或7 型HAdV 灌装进肠溶胶囊进行口服，可使胶囊在胃部不释放，选择性的感染下肠道［23］。最初用人胚胎肾细胞培养病毒，但这种原代细胞由于潜在的肝炎或其他病原污染的可能性而不适合大规模的疫苗生产，Wistar 研究所分离的诸多可连续传代的人胚二倍体细胞成为首选［24］。CL68578（HAdV4）经 WI-26 细胞分离，随后仅在 WI-26 和 WI-38 两株细胞上连续传代；55142（HAdV7）分离后在人胚肾细胞HEK 上传代5 次，随后在WI-38 细胞上传代13 次［25］。美国惠氏公司实验室将病毒经冻干后与微晶纤维素和乳糖混合，60 mg 分装入胶囊中，并在胶囊外涂抹一层邻苯二甲酸酯肠衣［26］，志愿者口服胶囊疫苗后，病毒在肠道释放呈无症状感染且产生中和抗体。经过长时间观察，未在呼吸道及血液中检测到HAdV，表明病毒不会扩散至上呼吸道并且不会产生病毒血症。病毒最快可在第2天随粪便排出，最长可持续21 d，但在23 人的小规模试验中，接触志愿者的易感人群并未被肠道排出病毒感染［27］。由于胶囊中某些成分导致病毒效力降低，惠氏公司用口服肠溶片取代胶囊。尽管随后的2 项临床数据表明，肠溶片疫苗可将HAdV 感染降低90%以上，但疫苗免疫后产生的中和抗体强度要低于自然感染，惠氏的回复是与感染的严重程度有关［28］。在21 型口服疫苗的人体试验中，血清中检测到IgA 而鼻腔分泌物中未检测到，导致对黏膜免疫的作用产生了质疑［29］。自1971 年开始，美军开始在新兵训练营实施口服4 型和7 型HAdV 疫苗的免疫计划，直至1996 年，生产商惠氏公司由于厂房需升级改造停止生产，随后几年HAdV 感染在美军中再次爆发［30］。

自2000 年，美国国防部开始加速寻找替代供应商，随后Barr 实验室承接惠氏公司的生产工艺并对剂型升级为口服肠溶包芯片，于2004 年开始临床试验［31］。58 名美国陆军军校生参与了Ⅰ期临床试验，疫苗组和安慰剂组的不良反应发病率基本一致。最常见（＞10%）的不良反应报告为鼻塞、咳嗽、喉咙痛、头痛、腹痛、腹泻、恶心，关节痛和鼻窦炎等，但均未影响日常训练。在第56 天，疫苗组对4 型和7 型HAdV 的抗体阳转率分别达到73%和69%［25］。在Ⅲ期临床试验中，有4 000 名美国陆军和海军士兵参与，91.9%的疫苗组和93.9%的安慰剂组接种者报告了不良反应，但严重不良反应均占1.2%。疫苗组对4 型和7 型HAdV 的抗体阳转率分别达到94.5%和93.8%。该疫苗对预防由4 型HAdV 引起的发热性呼吸道疾病的有效性达到99%；尽管在临床期间未观察到7 型HAdV 引发疾病的病例，但FDA 认可7 型的血清学结果，准许上市［32］。自2011 年上市后至2012 年底，Barr 生产了超过27 万剂疫苗，近21万美军士兵参与了免疫计划，由HAdV 感染导致的呼吸道疾病发病率迅速下降；在后续7 年的持续临床观察中，也未发现由HAdV 口服疫苗导致的意想不到的不良反应［32-33］。

3 重组HAdV 疫苗

来自广州医科大学的周荣团队对HAdV 疫苗进行了长期的研究。通过分子生物学方法构建了1 株具备感染性的重组3 型HAdV，随后将已知的7 型HAdV 六邻体表位基因整合至重组3 型HAdV 上进行表位替换，继续将重组3 型HAdV 的E3 基因替换为55 型HAdV 的六邻体基因，最终构建出的重组HAdV 可在小鼠体内产生针对3 种型别HAdV 的抗体，在病毒攻击时能有效降低肺部病毒载量。组织病理学观察显示，未经免疫保护的小鼠肺部呈明显的急性炎症反应，由炎症细胞渗透导致肺泡壁明显增宽，肺泡萎缩减少［34-36］。通过分子生物学方法分别将 7 型、14 型、55 型 HAdV 的六邻体基因与 3 型HAdV的六邻体进行替换，包装出不同型别的HAdV，通过β 丙内酯灭活制备的四价HAdV 灭活苗可在小鼠体内产生均衡的中和抗体应答，彼此不会产生免疫干扰［37］。然而其制备过程中使用的癌细胞不具备疫苗生产资质，更换为Vero 细胞或人二倍体等细胞后是否能工艺重现、满足生产需求仍待进一步研究。

4 流感载体疫苗

流感减毒活疫苗（live attenuated influenza vaccine，LAIV）是一种已获批准的流感疫苗，经鼻腔给予LAIV 可诱导产生黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫等多重免疫应答［38-39］。将冷适应、减毒流感病毒的6个内部基因及HA、NA 基因通过反向遗传学方法可包装拯救出LAIV，如果将某些病毒的中和表位嵌入HA 或NA 基因中，则可包装出具备嵌合表位的重组减毒活流感病毒［40］。如将呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的 G 蛋白或 F 蛋白的中和表位嵌入HA 基因中包装出的重组病毒可在小鼠体内产生针对特异性RSV 的中和抗体，并且在病毒攻击时不会产生肺组织病理改变，结果表明，流感病毒载体能有效地提呈外源病毒表位并产生保护［41-42］；将 HAdV 六邻体蛋白中和表位的 2 个重复序列嵌入NA 基因中，包装出的重组病毒对小鼠滴鼻免疫后可产生较好的体液免疫应答，在肺鼻灌洗液中检测到黏膜sIgA 抗体并可诱导产生细胞免疫应答［43］。将3 型和7 型HAdV 的六邻体蛋白的 8个不同表位嵌入NS1 基因，也能在多种细胞中成功包装拯救出重组病毒，滴度高达107PFU ／ mL。小鼠通过滴鼻免疫后可产生强大的体液、黏膜和细胞免疫反应，既能对流感病毒又能对两种型别的HAdV产生保护［44］。LAIV 已经在俄罗斯应用超过30 年，在美国和欧洲也已上市多年，2020 年也在我国上市，安全性均得到了有效验证［45-46］。在新冠疫情期间，国内疫苗企业研发的携带新冠病毒刺突蛋白基因片段的流感病毒减毒疫苗株也已获得国家药品监督管理局的临床试验批件（批件号：2020L00039），该疫苗可通过鼻腔喷雾的方式接种，模拟呼吸道病毒天然感染途径，激活局部免疫应答和全身性免疫应答而发挥保护作用。这些试验表明，在流感病毒载体基因中插入外源基因片段不会改变病毒自身属性，基于流感病毒载体的HAdV 疫苗有待进一步的临床前和临床研究。

5 核酸疫苗和基因工程亚单位疫苗

随着现代生物学技术的发展，逐渐出现新的疫苗形式。新冠的流行给mRNA 疫苗带来了历史性的机遇；亚单位疫苗由于其良好的安全性、稳定性和经济性等也有望逐步替代传统疫苗［47-50］。但以上两种形式的疫苗均依赖于免疫原的选择，mRNA 疫苗还有赖于高效的递送系统［51］。AdV 衣壳主要由3 种结构蛋白组成，分别为六邻体蛋白、纤突蛋白和五邻体蛋白。虽然针对3 种衣壳蛋白均能产生中和抗体，但相关研究表明，六邻体蛋白是主要的靶点，为目前研究较多的抗原结构蛋白，并且已经发现诸多针对六邻体的单克隆抗体［52-55］。无论是核酸疫苗还是基因工程亚单位疫苗均应对免疫蛋白抗原进行深入的研究和筛选，寻找适应的动物模型充分评价这些蛋白的免疫保护效果，获得高免疫保护性的抗原来制备疫苗无疑会明显降低疫苗的生产成本。

6 讨论及展望

HAdV 引发的呼吸道疾病，在中国曾引发间歇性的流行爆发，尤其是21 世纪以来的55 型，在我国首次出现即引起数百人感染。AdV 感染不存在特效药，有效的预防手段仍然是疫苗接种，相比于流感、呼吸道合胞病毒而言，国内对于HAdV 的关注和研究较少。目前，全球范围内仅美国对HAdV 疫苗进行过系统性的研究，并拥有全球唯一的HAdV 口服活疫苗。而中国人口密集大，为了预防易感人群感染，需尽早开发HAdV 疫苗。但开发何种形式的疫苗、如何确立相应的检测方法和质量控制标准均是未来需面对的挑战。对于口服活疫苗，病毒排出是否会污染公共卫生环境以及生物安全上的风险值得关注；而减毒株的筛选与分离需大量的筛选工作和减毒特性验证，动物细胞驯化的减毒株能否返祖引发更大规模更严重的感染也需重点关注；灭活疫苗的抗原如何检测、疫苗效力如何测定以及缺乏国家标定的标准品，这均需企业与国家职能部门有效配合；未来针对HAdV 的新型的亚单位疫苗、病毒载体疫苗及DNA ／ mRNA 的核酸疫苗等对预防疾病感染的有效性仍有待进一步科学研究；不同亚型的AdV 利用不同的受体进行感染以及AdV 受体（CAR、DSG2、CD46）在人与鼠及其他模式动物间的较大差异性，导致缺乏科学有效的动物模型来进行有效性评价；以上这些问题均限制着疫苗的研发，亟待科研人员解决［56-58］。

综上所述，AdV 作为病毒疫苗载体而被熟知，但其导致的呼吸道疾病的感染却始终未引起社会关注。随着GSK 公司重组带状疱疹疫苗的引入及国内疫苗厂家相应产品的临床申报，HAdV 疫苗将成为国内极少数欠缺的疫苗，因此应重点关注HAdV疫苗的研发。