新型冠状病毒重组疫苗早期研发药学关注要点

程速远，刘志磊，郭舒杨，任慧梅，梁争论，胡忠玉，何鹏，李敏

1.国家食品药品监督管理局药品审评中心，北京100038；2.中国食品药品检定研究院，北京102629

目前，新型冠状病毒（SARS-Cov-2）仍在全球大规模流行，由于其传播速度快，发病率高，已对全球超过3 211 万人产生影响，成为一个严峻的公共卫生问题［1-3］。多个国家或地区的企业和研究机构正在积极进行新型冠状病毒疫苗（简称新冠疫苗）的研发，根据世界卫生组织（WHO）统计，目前全球在研新冠疫苗超过160 个，已有10 种疫苗进入临床Ⅲ期试验阶段，分别有2 种和21 种进入临床Ⅱ期和Ⅰ期试验阶段。国内现有5 条技术路线的多种新冠疫苗也在同步快速推进。

新冠重组疫苗通常采用CHO 细胞等表达的新冠病毒的S 蛋白表面受体结合结构域（rece-ptorbinding domain，RBD）抗原，经纯化后，加入佐剂制成。本文就新冠重组疫苗质量控制和技术评价要点进行归纳，强调生产过程的一致性，并参考目前达成的阶段性共识，阐述审评的关注和考量，以期为5 条技术路线之一的新冠重组疫苗药学研发提供参考。

1 一般考虑

临床试验用样品应在符合GMP 的条件下生产。其药物研发原则上应遵循新冠疫苗系列技术指导原则（试行）、《中国药典》以及 WHO、ICH 等国际组织有关技术要求，并根据其作用机制、递呈方式和免疫应答的诱导等核心要点，开展相关研究工作。

动物试验表明，虽然SARS 候选疫苗诱导的中和抗体具有一定的保护作用，但由于细胞免疫在病毒和感染细胞的清除中起至关重要的作用，为实现长效保护机制，新冠疫苗设计需同时考虑体液免疫和细胞免疫［4］。此外，由于呼吸道和接触是新冠病毒主要的传播途径，黏膜免疫在防止病毒感染中的作用也不容忽视。新冠病毒的结构蛋白包括4 部分：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。S 蛋白通过RBD 与细胞表面受体ACE2特异性结合后感染细胞，与S 蛋白或RBD 结合的中和抗体可通过阻遏新冠病毒与细胞的结合从而防止病毒感染；同时，S 蛋白还能有效刺激T 细胞产生特异性免疫应答，因此，S 蛋白或RBD 通常作为疫苗研发中最关键的目标抗原。此外，N 蛋白和M 蛋白也被证明可诱导机体产生一定的细胞免疫反应［5］。

1.1 目的基因和分子设计 建议目的基因选择新冠病毒保护性抗原的基因序列，按照重组蛋白的技术要求构建重组蛋白疫苗的生产用工程菌毒株。应充分考虑目的蛋白与野生新冠病毒结构和翻译后修饰上的一致性。新冠病毒的S 蛋白RBD 的几个关键氨基酸残基与ACE2 之间存在重要的相互作用，因此，新冠重组蛋白疫苗通常采用RBD 作为免疫原。根据目前的研究进展，ACE2 被认为是阻断新冠病毒进入宿主细胞治疗冠状病毒感染的关键宿主靶点。

建议重点关注新冠病毒基因序列的来源、流行株的代表性，考虑所选目的基因对安全性［如对疫苗抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement，ADE）效应、肺部免疫病理反应等的潜在影响］、免疫原性（如抗原表位分析、不同毒株之间的交叉保护作用等）、抗原表达（如天然多聚体 ／ VLP 形成等）以及病毒抗原完整性等方面的影响，可结合必要、适用的细胞水平病毒中和试验、抗原谱或表位分析试验开展研究。

由于天然的RBD 序列为糖基化修饰蛋白，建议尽量选择哺乳动物细胞系作为宿主细胞。翻译后修饰通常影响蛋白的空间结构和生物活性，糖基化作为一种重要的翻译后修饰形式，参与蛋白质的折叠、运输、定位、受体激活、信号转导等多种关键的生物学活性，且影响蛋白稳定性、药代动力学和免疫原性等。因此，糖蛋白功能的发挥，不仅依赖蛋白的正确表达及其高级结构的形成，糖基化的正确修饰也具有同等重要的作用。因此，糖基化修饰既是完整的生物学活性所必须，也是生产工艺过程研究和质控的重点［6］。由于大肠埃希菌是原核生物，表达的蛋白无糖基化修饰，生物学活性会受较大影响，应慎重考虑采用大肠埃希菌作为宿主细胞。

2020 年3 月，美国佐治亚大学在Emerging Microbes & Infections 杂志上发表论文［7］：采用 293 细胞分别表达新冠病毒S 蛋白的S1 和S2 亚基，蛋白酶切后通过质谱法进行糖谱解析到22 个潜在N-糖基化位点，其中17 个有糖基化修饰，剩余5 个潜在N-糖基化位点未发现糖基化修饰。糖基化修饰主要为高甘露糖型和复合型，不存在杂合型。此外，还从S1 蛋白的 RBD 区域鉴定出 2 个 O-糖基化位点（O323 ／ O325）。另外，英国南安普顿大学和美国德克萨斯大学奥斯汀分校在bioRxiv 发表论文［8］：采用293F 细胞重组蛋白表达新冠病毒S 蛋白，蛋白酶切后通过质谱法鉴定出S 蛋白上22 个N-糖基化位点，其中18 个为保守位点，并采用冷冻电镜在3D结构绘制了S 蛋白三聚体糖蛋白图谱，揭示了N-连接多糖是如何遮蔽S 蛋白表面不同区域的。考虑到受体结合位点的功能性限制和这些残基的低突变率，作者猜测，可能病毒利用N-连接多糖来遮蔽最保守和易受攻击的区域。中国四川大学华西医院在bioRxiv 发表论文［9］：对市售新冠 S 蛋白（昆虫细胞表达）和S1 蛋白（293 细胞表达）的位点特异性N-糖基化进行特征分析，也是采用酶切后质谱分析方法，昆虫细胞表达的S 蛋白共鉴定出22 个N-糖基化位点，主要为高甘露糖型修饰，共含有38 种多糖；而293 细胞表达的S1 蛋白主要为复合型糖基化修饰，共含有140 种多糖。提示采用昆虫细胞和293 细胞表达的S 蛋白，其糖链修饰类型和多糖组成差异较大。上述3 篇论文均通过质谱法对体外重组表达的新冠病毒S 蛋白的糖基化位点和糖链类型进行了全面分析，由于不同表达体系细胞的翻译后修饰系统不同，导致表达的S 蛋白的糖基化水平和糖型种类有很大不同。而在上述3 篇论文中，同样采用293 细胞表达的S 蛋白的糖基化修饰和多糖组成也存在明显差异，表明重组S 蛋白的糖基化修饰具有多样性和异质性，应引起新冠药物及疫苗研发企业的重视。

基于目前的研究对新冠病毒的认识尚不全面，建议研发者密切跟踪新冠病毒结构和活性方面的基础研究，选择合适的分子结构作为抗原，关注糖基化修饰和高级结构，以获得较好的疫苗免疫效果。

1.2 临床前及临床期间工艺变更 药学变更贯穿于药品研发的各阶段，特别是研发早期。开展临床前药理毒理研究及临床试验研究的样品建议采用工艺代表性（生产用原材料、生产工艺、生产场地、生产规模、制剂处方、包材等）批次。建议在早期临床阶段，即建立与产品安全性相关的包括工艺参数和可接受标准的过程控制；为了积累产品及工艺知识，在早期应建立尽可能多的过程控制指标，为变更前后质量可比性研究及可能出现问题的评价积累数据，待积累足够数据并充分验证后再考虑适度减少控制指标。建议在关键临床试验阶段采用与拟上市生产规模相当的生产工艺和质量标准。

临床试验期间常见的变更包括生产规模放大和工艺优化等，为评估变更对产品质量的影响，应开展充分的质量可比性研究，包括但不限于结构表征、批分析、稳定性、可比性研究等。可比性研究应进行合理设计，包括纳入可比性研究的批次、比对研究项目、可比性验收标准等，还应关注研发各阶段代表性批次的留样问题。如质量可比性研究结果不能充分说明变更未产生不利影响，可能需要提供额外的非临床研究、甚至临床研究资料进行桥接，如免疫原性比较和必要的安全性比较等。鉴于新冠疫苗的复杂性及目前认知的有限性，对于临床期间的重大变更，建议开展变更前后细胞免疫、体液免疫等全面的效力研究的比较分析。

2 药学关注要点

2.1 生产用原材料 由于生物制品生产用原材料来源较复杂，存在引入外源因子的风险，应对生产用原材料进行严格的来源分析和质量控制。重组疫苗生产用原材料在此基础上，尤其需关注生产过程中所用的动物源性材料，并评估其安全性风险，包括引入外源因子的风险。鼓励采用符合各国药典要求或已用于上市产品的原材料。

生产用原材料应符合《中国药典》相关规定或与国际通行要求一致。对于生产中所用的关键原材料，包括蛋白水解酶、亲和抗体、化学修饰物等，若为外购产品，应明确质量标准，并进行严格的供应商审计；若为自行生产，则应在申报资料中提供生产工艺、质量控制和稳定性等研究内容，并关注批间一致性。若使用一次性发酵袋／ 储液袋、滤膜／滤器、层析柱填料等，应进行相应的安全性评估，其质量应符合《中国药典》相关规定，或与国际通行要求一致。

2.2 上游构建和毒种库建立 宿主细胞应来源清晰、可溯源，应提供生产用细胞基质的来源、可用于生产的研究资料或证明文件、历史（包括建立细胞系、鉴定和传代等）。应进行全面检定，特别是生物学特性、核型分析、外源因子检查、成瘤性和 ／ 或致瘤性检查等，并提供相应检定结果。如使用已用于其他上市疫苗的细胞基质，可简化提供相应的证明性材料或只提供承诺说明。

工程细胞株构建过程应清晰，需说明传代、基因操作方式，克隆筛选及鉴定、检定情况，构建过程中应筛选目的基因完全正确的细胞株，重组蛋白疫苗应与主要流行毒株和 ／ 或假毒株在诱导中和抗体方面具有可比性。通常采用蛋白表达量高且稳定性好的克隆作为疫苗生产用细胞，建立三级细胞库。应说明各级细胞库传代方法、制备过程、建库规模、限传代次和储存条件。应明确主细胞库和工作细胞库的代次，按照《中国药典》规定进行鉴别试验、无菌检查、遗传稳定性、抗原表达水平和免疫原性等检定。提供各级细胞库（包括生产终末细胞）的检定报告，检定项目包括外源因子检测、鉴别试验、特性和型别、感染性滴度、抗原性、免疫原性及保护性抗原的完整性等；主细胞库还须进行基因序列测定。细胞库系统的建立、检定等需满足《中国药典》要求。在应急状态下，至少建立一级生产用细胞并完成全面检定；对于细胞库免疫原性检测项目可结合药效学研究开展，建立初步的标准，在临床期间逐步完善。

确定限定代次的研究资料；检定项目除参考细胞库检定项目外，还需进行基因测序考察，鼓励采用先进的技术方法对传代过程中目标成分基因序列及目的产物质量特性进行考察。在应急状态下，为鼓励疫苗研发，该部分可采用模拟传代方式开展相关研究，在适当传代代次进行有代表性的试验，应能支持临床样品的生产。

2.3 生产工艺 临床样品制备工艺应具备一定规模，具有一定的生产连续性和放大可行性。需提供初步的工艺确认资料；提供工艺相关杂质和产品相关杂质去除效果等初步研究资料。

应提供生产工艺相关资料，包括工艺流程、关键步骤的工艺参数及控制范围。为保证产品安全性，应关注发酵培养中的污染控制情况及相关检测结果，需提供初步的未处理收获液或生产终末细胞外源因子检定报告。申请人应关注实际的病毒去除／灭活工艺，通常每个步骤的病毒清除能力应至少由两次独立的研究加以重复验证。应明确病毒去除 ／灭活验证过程中验证样品的具体参数，包括蛋白含量、pH、过滤压力差、过滤量等，病毒去除 ／ 灭活验证结果应支持临床使用批次的病毒安全性。

工艺研究可在平台先验工艺经验基础上进行，但需有本品的研究和验证数据。如有研究简化，需提供充分理由。

应明确制剂处方中每种组分的作用及含量，提供佐剂、缓冲液、盐浓度、pH 以及其他辅料的选择依据；如使用特殊的抗原递呈系统，如脂质体、聚合物微粒等，应至少提供递呈系统所用组分的质控标准、递呈系统组分含量的选择依据等。应通过不同制剂处方对抗原-佐剂 ／ 递呈系统相互作用（如吸附率、包封率、包封粒径等）、动物药效学研究（免疫原性、保护力研究）、毒理研究、生产工艺可控性等方面的影响进行筛选并确定初步的处方。

对于国内外已上市产品中从未使用过的全新辅料，应进行关联申报。

应提供辅料、佐剂来源及质量标准相关资料。应急条件下，建议采用符合《中国药典》标准的辅料。研究资料（包括研究方法、研究结果和研究结论）应说明制剂工艺关键步骤确定的合理性以及工艺参数控制范围的合理性，包括主要工艺参数研究资料，生产工艺参数对产品质量属性的影响等研究资料。

如产品使用佐剂，应按照原液申报格式提供原材料、生产、特性鉴定、质量控制和稳定性的研究资料。

由于应急状态下对病原体知识积累有限，且研发早期批次和数据少，鼓励尽量积累过程控制指标相关的产品知识和工艺知识，为工艺放大或工艺优化后的可比性研究及可能存在的问题奠定基础。研发初期，应至少提供可支持开展临床试验用疫苗的制备工艺控制要求，关注生产工艺的批间一致性。

2.4 质量研究

应对药理毒理批次和 ／ 或临床样品批次等代表性批次样品进行全面的、与研究阶段相适应的特性分析和质量研究。提供常规放行检验分析及采用先进、灵敏的分析技术进行的质量研究和特性研究数据。

特性研究通常包括结构确证、生物学活性（结合及中和活性）、免疫学特性、纯度（分子大小及电荷异构体）和杂质（工艺及产品相关杂质）、体内外效力、免疫学特性等研究。研发早期阶段，建议提交初步的结构确证研究数据，可在上市申报时提交完整的结构确证资料。疫苗的生物效价研究是反应工艺性能和产品质量的综合指标，建议尽早开展相关研究。

2.4.1 结构表征分析 提供常规放行检验分析及采用先进的分析技术进行的质量研究和特性分析研究数据。特性分析通常包括结构特征、纯度、杂质分析（工艺相关杂质及产品相关杂质）、体内外效力、免疫学特性等研究。除常规放行检验项目外，鼓励对影响疫苗效力或安全性的其他结构特征开展研究。糖基化可能影响免疫原性，鼓励进行相关研究，若不能排除糖基化对疫苗效力的影响，需在方法学研究到一定程度并积累数据后，将糖基化相关检查纳入质量标准。

重组疫苗除参照重组治疗用生物制品要求提供适用的相应资料外，对于形成病毒样颗粒的疫苗，还应提供病毒样颗粒关键结构研究的相关资料。如是纯化的抗原肽或具有保护性特点的表位肽，应提供必要的正确性鉴定研究结果。

如涉及佐剂或新型抗原呈递系统，应结合其与抗原相互作用的结构或特性开展必要的质量研究，理化结构特性如佐剂等电点、粒径及其分布、与抗原的吸附铝等；脂质体包封率、粒径等；生物学活性如佐剂或新的抗原递呈系统对抗原的呈递效果、降低佐剂或抗原毒性和／ 或增强抗原免疫反应的相关研究等。

2.4.2 纯度和杂质 应采用多种检测方法（检测原理不同）联合检测分析供试品纯度，检定结果应不低于同类产品标准。

杂质指生产工艺、贮存、和／ 或用于保存原液的密封容器中产生的、和 ／ 或稳定性研究批次中发现的潜在杂质，包括工艺相关杂质和疫苗的降解杂质。对于早期临床试验申请，可根据来源、风险及残留量的安全性水平等，列出潜在的杂质及当前拟定的质量标准（建议结合毒理试验结果、文献资料、既往积累的认知信息等综合考虑）。对于开发后期临床试验，除了早期临床试验申请提供的信息之外，还需进一步进行杂质的分离、鉴别、对生物活性影响的分析，并关注检测方法的方法学验证。考虑其在生产和贮存期间是否显著增加及其与疫苗有效性的相关性，确定是否纳入过程控制或放行标准；对于需纳入质控体系的项目应随研究的逐步推进加强标准要求，如通过工艺验证可有效清除，可结合工艺进行控制。

2.4.3 生物效价 与常规疫苗研发相似，重组疫苗也需进行体内效力、体外效力及动物保护的研究。

体内效力试验首选的方法为中和抗体检测方法。此外，还可采用测定小鼠ED50的方法。应选择适宜的实验动物品系，建立检测动物血清中和抗体或总抗体的方法，包括中和试验毒株、包被抗原、参比品的研究等。如有必要和可能，鼓励建立抗体性质的评价方法，如亚型测定、针对抗原中和位点的分析等。

体外效价检测一般是对疫苗抗原含量的检测，需建立疫苗抗原含量的检测方法，包括制备检测用参比品等，并进行方法学验证。动物保护性试验是最理想的临床前有效性评价及质量控制手段之一，可结合药效学研究开展。由于对病原体认知有限及不同种类疫苗免疫机制不尽相同，鼓励对细胞免疫水平的生物学活性开展相关研究。

质量标准中需纳入针对新冠病毒的体内效力指标。如能建立有效的佐剂解离方法，建议在此基础上建立抗原含量检测作为体外效力测定方法。

2.4.4 质量标准方面 质量标准应包括检查项目、检查方法及标准限度，通常以列表形式提供。建议明确质量标准的拟定依据，包括是否符合我国或国际通用的有关技术指导原则、各国现行版药典的要求等，说明设定各检查项目和各项检查方法选择的考虑，根据临床前药理毒理批检验结果、初步的工艺知识、稳定性等研究结果，评估质量标准限度范围设置的合理性。

重组新冠疫苗质量标准应包括鉴别、纯度（两种机理的方法）、杂质、体内效力等。

申报临床时提供的方法学验证资料应能初步证实检测方法的适用性，对重要指标或关键质量属性（如保护效力、抗原量、免疫原性、灭活试验等）的检测方法，应提供与研发阶段的控制及重要性相符或适用的验证资料；上市阶段应按照相关指导原则提供全面的方法学验证资料。

应提供建立的参考品或对照品来源、制备、检定结果、标定过程及稳定性研究（定期复检）等方面的初步研究资料。

2.4.5 参比品研究 应积累不同研究阶段参比品的详细信息，包括但不限于批次来源、制备工艺、检验结果、标定方法和结果、储存条件和复验期等，应关注参比品的代表性及可溯源性。此外，为确保产品质量的可溯源性，建议对关键质量属性生物活性和纯度等的参比品开展全面研究。

2.5 初步稳定性研究 通常稳定性研究方案设计应遵循生物制品稳定性指导原则［10］。临床申报阶段应提供能够支持临床试验开展的稳定性研究数据。应关注关键项目的代表性图谱、降解途径和变化趋势等。

应急情况下，若考虑减少批次，需提供充分的支持依据。实验条件及持续时间需能够支持临床试验的开展，后续继续完成本批次以及其他批次的稳定性研究，进行滚动提交稳定性研究数据，若有异常，需及时上报。

建议将新冠疫苗的体内效力指标作为关键指标纳入稳定性研究的考察指标，待积累产品开发各阶段的多批次数据后，再结合体内效力的稳定性数据综合考虑完善后续稳定性研究。

2.6 包装系统及包材相容性 应明确包材来源、质量标准等信息，鼓励采用已批准或已用于上市产品生产的包材、容器。

若涉及特殊给药装置，如无针注射器、雾化器、鼻喷装置等，需提交相关研究资料。如有可替代或支持性的其他研究资料，应提交说明。

对于使用雾化给药或鼻喷给药的品种，应结合拟使用的给药装置，参照《中国药典》吸入剂或鼻用制剂和喷雾剂各项规定开展研究，并提供相关研究资料，并进行临床使用中稳定性等研究。

包装容器的选择，应关注与药品接触的内包材对药品的保护性和相容性，如容器内表面可吸附蛋白、胶塞可能产生微粒、玻璃包材会发生玻璃脱片等问题，可在临床试验期间按照相关法规和指导原则的要求规范开展完善的包材相容性研究。

2.7 制造和检定记录 应提供确定用于临床试验的工艺、规模及生产线生产的样品制造和检定记录。尽可能包括详细的制备控制技术条件和参数，便于溯源、事后分析改进、充实、完善相应的控制要求。

原则上，申报临床试验应提供能代表临床样品工艺的3 批产品的制造和检定记录，且批量需满足临床试验需求。应急情况下若考虑减少批次，需提供充分的支持依据，如已有早期数据或平台先验工艺经验支持的、关键参数控制基本明确、过程监测数据较为充分、药学可控度高等；并在开展早期临床研究的同时，继续按照常规注册要求进行多批次生产，以确认工艺的稳健性和可控程度。

2.8 采用非建库或非单克隆细胞库模式的考量 为加快临床样品研究，部分申报单位提出，采用瞬转或非单克隆细胞池技术进行药理毒理和／ 或早期临床样品工艺开发研究。尽管采用瞬转或非单克隆细胞池生产可适当缩短工艺开发周期，但其带来的不同批次产品质量的不确定性和变异性也需格外关注。建议根据疫情发展的急迫程度以及对产品工艺变化导致的影响产品质量的控制能力，慎重考虑并制定早期工艺开发路线图。原则上，建议采用经筛选的单克隆细胞建库生产临床试验样品。

如拟采用瞬转或非单克隆细胞池进行IND 申报，需充分证明其建立的瞬转系统、非单克隆细胞池能支持后续研发，并提供细胞库的检验报告，确保可稳定转染，且无内、外源因子污染的风险。

若采用瞬转技术产品用于早期临床，需提供足够的工艺信息（至少覆盖3 批样品），以证明瞬转技术的稳健性及一致性；需提供至少3 批样品的全面特性分析（如翻译后修饰等）、质量研究及稳定性分析数据，并提供3 批样品制造和检定记录，以证明瞬转技术的产品质量及稳定性批间一致。应重点关注安全性相关的药学研究，包括工艺相关物质、产品相关物质及遗传毒性杂质分析和控制，关注检测方法的特异性、灵敏度等方法学验证研究。

若采用非单克隆细胞池生产，需提供非单克隆细胞池支持临床样品生产的传代稳定性信息，代表性批次（药理毒理批次、临床样品批次）的工艺信息、特性分析（如翻译后修饰等）、质量研究及稳定性分析数据，以证明非单克隆细胞池传代及生产的稳健性及质量一致性。

若采用瞬转或非单克隆细胞池生产，后续研究还需评估瞬转技术、非单克隆细胞池造成的产品质量差异对药学、非临床研究以及临床试验的影响；应证明非临床研究用药物与拟进行临床试验用药物的相关性，为后续临床试验提供安全性支持。如研究资料证明不足以支持产品安全性和批间一致性，将导致临床研究的停滞［11］。

3 讨 论

3.1 平台知识 既往有关应急疫苗研发或生产的平台知识、工艺知识、产品知识等将有利于本次应急产品研发的评价，鼓励产品知识、工艺知识积累较多的平台化产品与创新结合快速开发。根据研发疫苗的作用机制、递呈方式和免疫应答的诱导等核心要点，对研发制备工艺中的关键步骤进行研究，建立合理的过程控制、技术参数范围及初步适用的质量控制标准。

3.2 临床期间需进一步完善的药学研究 新冠疫苗的药学研究针对重大公共卫生紧急需求研发，其阶段性、渐进性的特点需提前统筹设计考虑，在符合基本的安全性、有效性及质量可控性的前提下，新冠重组疫苗可有条件批准进入临床试验。临床试验期间，可进一步完善相关药学研究，包括且不限于更全面的结构确证、完善的方法学验证、糖基化修饰及有关物质对疫苗效力的影响、包材相容性、完善的稳定性研究等。

4 小 结

新冠重组疫苗的生产工艺和质量控制可部分参照重组生物技术产品的技术指导原则，但由于新冠病毒属新型病毒，高级结构和翻译后修饰又较为复杂，建议研发机构遵循质量源于设计的原则，在分子及工艺设计科学合理的前提下，循序渐进完成药学部分的研发。在新冠疫苗的早期研发中，药学研究作为非临床研究及临床研究的基础，可为非临床研究及临床试验的实施提供支持，早期药学研究的科学规范可为临床研究的顺利开展奠定良好的基础。