含抗生素废水的微藻处理技术及其进展

钟雪晴，朱雅莉，王玉娇，赵权宇

（1 南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211816；2 南京工业大学药学院，江苏南京211816）

抗生素在人类疾病治疗和水产养殖等行业发挥着重要作用，但是抗生素过量使用也造成其在环境中累积，部分水体和土壤中均已检测出微量的抗生素。抗生素根据结构和官能团等可以分为β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类以及林可酰胺类等。一般使用半数效应浓度（EC50）判断抗生素的环境毒理影响。EC50值越小，代表毒性越大。环境中残留的抗生素会影响微生物群落构成、降低土壤酶活性、影响微生物生长等[1]。抗生素通过水体和土壤进入食物链，最终被人类摄取，产生耐药性。广泛耐药性的产生将降低人类疾病的治疗效率，提高治疗成本，甚至对特殊病原菌失去有效治疗手段，已经成为全球威胁。亟需严格控制含抗生素废水排放，切断抗生素进入环境的途径，保障人类健康。

目前，物理、化学和生物手段均是处理含抗生素废水的可能途径。一般来说，含抗生素废水成分复杂，竞争性物质的存在降低了吸附剂对抗生素的吸附选择性，去除效率受到严重影响。物理法中膜处理法由于膜污染使得通量下降，降低了处理效率[2-3]。化学法中光催化或臭氧氧化处理可能会产生其他有害中间产物，存在二次污染的风险[4]。物理法和化学法需要消耗能量将抗生素分离或降解，但是不产生附加值。生物法去除抗生素如传统活性污泥法，其初衷是为了满足水质排放的要求，处理后废弃污泥的处理成本占总成本的50%～60%[5]，其他去除方法如人工湿地技术，目前还存在设计规范欠缺、湿地堵塞等问题[6-7]，所以需要探索高效、节能的方法去除抗生素。微藻能利用光能和CO2进行高效的光合作用，具有降解有机污染物、去除重金属离子以及改良盐碱地等潜力[8-9]。同时，微藻生物炼制可以产生有价值的副产物，如色素、脂类或生物燃料等[10]。根据国外最近的研究，微藻处理医疗废水后干细胞质量浓度可达0.52g/L，脂含量占28%[11]。所以，基于生物炼制概念用微藻处理含抗生素废水后，还可以获得高附加值产品，是具有潜力的含抗生素废水处理技术，并对实现资源循环利用具有重要意义。本文结合近年来微藻处理含抗生素废水的部分探索性工作，重点综述了微藻去除抗生素的机制和工艺条件。

1 含抗生素废水的产生及其危害

抗生素在医学、畜牧养殖业以及水产养殖业发挥着重要作用，广泛用于预防或治疗微生物感染问题[12-13]。根据全球抗生素消耗量调查结果显示，在2000—2010 年期间抗生素药物的消耗量从54083964813 个标准单位增加到73620748816 个标准单位，增加了36%[14]。此外，每年全球药品和个人护理用品（PPCPs）的消耗量达到10000t。人体不能完全利用的抗生素随生活污水进入废水处理厂，而多数废水处理厂不能高效处理含抗生素废水，迄今已在国内外的地表水[15]、废水处理厂[16]、海水[17]、地下水[18]以及饮用水[16]中检测到微量的抗生素。部分国内外环境水体样本中典型抗生素浓度见表1。含抗生素废水主要来自以下几个方面：①制药废水，制药企业在药物合成中产生的抗生素流入环境中[31]；②用药后产生的废水，医疗单位及养殖业抗生素的过量消耗，有一部分抗生素不能代谢，流入到城市废水系统或河流；③废水处理厂（WWTP）排放废水，目前废水处理标准没有抗生素指标。含抗生素废水不能通过传统方法有效去除，而后流入到环境中[32]。Rizzo等[33]认为WWTP是环境中抗生素的重要来源。抗生素生产废水成分复杂，处理难度大。利用微藻去除抗生素的研究多数还停留在实验室阶段，使用BG11 等常见培养基或废水出水培养微藻，针对的也主要是面源污染问题[1]。

环境中抗生素的残留有多方面的危害。2015年9月，我国农业部发布的2292号公告，宣布停止使用洛美沙星（LOM）、培氟沙星（PEF）、氧氟沙星（OFL）及诺氟沙星（NOR）4 种兽药；然而，在我国部分湖泊中曾经检测出部分抗生素，如辽河中诺氟沙星的含量高达256.03ng/L，巢湖中洛美沙星的含量达5.5ng/L，太湖中OFL的含量达82.8ng/L（见表1）。环境中存在一些固氮微生物，在增加土壤肥力方面发挥作用。而环境中残留抗生素可能影响固氮微生物生长或者降低其在土壤的活性，这样就需要增加化肥的使用量，造成土壤板结等问题。耐药性基因（ARG）和耐药菌株（ARB）的传播，二者与难以治疗的感染/疾病相联系，造成延长住院时间和增加住院费用[1]，甚至公共健康事件。最后，人类是食物链的顶端，环境中的抗生素会通过营养级富集作用而使其浓度不断升高、食物链的逐级传递而危害人体健康。如残留在环境中抗生素可能诱发突变，对人体有潜在的毒性，严重可能造成致畸[34]。处理含抗生素废水是全世界均需重视的环境问题。2015 年5 月，世界卫生大会也提出行动计划要解决耐药性问题[35]。需要通过合理使用抗生素、规范收集养殖污染物及优化废水处理方法以高效去除废水中抗生素。在多种环境样本中均检测到一些常见抗生素，虽然这些抗生素的检测最大浓度在ng/L 水平，但是不能忽视其在环境中累积后的影响。表1 所示环境样本采集自各大洲，说明水体中抗生素的潜在威胁是全球性的问题。

表1 环境样本中典型抗生素浓度

2 微藻处理含抗生素废水的特点

自青霉素大规模生产应用后，有效处理含抗生素废水一直广受关注[36]。微藻生物技术是处理含抗生素废水的潜在方法。微藻能进行光合自养、异养和兼养，可以充分利用废水中的氮、磷和有机小颗粒等。该技术处理废水能减少营养物供给，处理后的藻类生物质再经提取得到有价值的副产物，形成了良性循环而吸引了研究者的目光（见图1）。已有大量研究表明微藻能有效去除市政废水、工业废水、地表水、生活废水、养殖废水以及医疗废水等废水中的污染物[11,37-39]。微藻处理含抗生素废水有以下几个优势：①微藻是可利用光能生长的自养型生物；②同菌相比，微藻能耐受更高浓度的抗生素[40]；③微藻不是抗生素的靶标生物，一定浓度的抗生素对微藻的生长繁殖影响较低[41-42]。抗生素在低浓度存在时能促进微藻的生长，高浓度抗生素也可能严重抑制微藻生长[8]，所以微藻处理含抗生素废水也受到一定的制约。

图1 微藻处理抗生素的流程

近年来有报道，将微藻法和其他技术相结合以增强抗生素的去除效率。如利用微藻和菌结合，系统中同时存在自养和异养代谢方式，去除有机物、重金属及病原体的效率更高[43]。Shi 等[40]用海水小球藻处理含150mg/L 阿莫西林废水，去除效率达85.6%±3.8%，如果微藻处理后含阿莫西林废水继续用潮间湿地沉积物或活性污泥处理，去除效率＞99%。在紫外光（UV）的照射下，抗生素会吸收光子进而破坏抗生素的化学键。Liu 等[44]用微藻和不同波长的UV结合去除头孢他啶，结果表明短波长UV 对抗生素的去除效率更高。Li 等[45]用微藻和Fenton 反应结合去除高浓度阿莫西林和头孢拉定，结果显示微藻法结合Fenton 反应去除效率优于单用微藻法。活性污泥法处理头孢拉定，去除率在22.1%～46.3%之间，单独使用小球藻去除率可达81.4%，混合使用活性污泥及小球藻，去除效率增加到97.9%，其中活性污泥贡献15.9%，藻类贡献82.0%[46]。与这些技术的集成有利于提高发挥微藻生物技术的优势以及处理含抗生素废水的可行性。

3 微藻去除抗生素的几种机制

3.1 生物表面吸附

抗生素在微藻表面的生物吸附即抗生素被吸附到微藻的细胞壁或者微藻分泌的胞外聚合物（EPS）上[47-48]。用灭活（热处理过或冷冻干燥）过的微藻处理含抗生素废水来评估微藻对抗生素的表面吸附能力[4,49]。Kiki等[50]考察了栅藻、月牙藻和小球藻处理不同抗生素时生物表面吸附的贡献。对磺胺类抗生素生物表面吸附的贡献仅占1%～4%，而喹诺酮类抗生素-洛美沙星（LOM）则不存在生物表面吸附，大环内酯类抗生素-罗红霉素（ROX）、克拉霉素（CLA）及阿奇霉素（AZI）有较高的生物表面吸附。不同微藻去除抗生素时生物表面吸附的贡献也存在藻种间差异。小球藻去除CLA、AZI及ROX 时的生物表面吸附占2%～4%，栅藻和月牙藻的生物表面吸附占6%～7%[50]。如果加入提取油脂后四尾栅藻的生物量大于2g/L，对10mg/L 四环素，3h内可以去除50%以上[51]，这主要是通过生物表面吸附去除的。微藻生物表面吸附与抗生素的亲/疏水性和电荷有关，一般来说疏水性高的抗生素更容易吸附[50]。

3.2 生物降解

生物降解是微藻去除抗生素的主要途径之一，包括胞内降解和胞外降解。

3.2.1 胞内降解

微藻胞内降解主要是通过酶催化完成的。微藻细胞内有复杂的酶系统，包括阶段Ⅰ酶和阶段Ⅱ酶家族[1]。首先去除以阶段Ⅰ酶（细胞色素450）为开端，通过氧化、还原或水解作用脱去羟基使抗生素更具有亲水性；阶段Ⅱ酶如谷胱甘肽S转移酶能催化亲电子化合物和谷胱甘肽发生结合反应，这样由于Ⅱ酶的结合使得一些环氧化合物的环断裂而保护藻细胞免受氧化[1]。当然，在藻细胞内降解抗生素是一个复杂的过程，利用组学手段了解每一种酶在胞内生物降解过程中发挥的作用，这对藻种选择具有重要的指导意义。 磺胺甲唑在Chlamydomonassp. Tai-03 中的降解存在3 条途径：①与苯环相连的氨基氧化；②与苯环相连的氨基氧化以及S—N 键断裂；③五元环被甲基替换，之后苯环加氢以及氨基氧化[52]，去除以前两条途径为主。甲氧苄啶在小球藻和雨生红球藻等微藻内的降解途径先后经历羟基化、去甲基和氧化、羟基化、环的断开以及去甲基和氧化，再经过键的断开和羟基化形成降解产物[50]。

3.2.2 胞外降解

微藻会分泌成分复杂的EPS 到外部环境，EPS的主要成分包括多糖、蛋白质和脂类等[53]，而且EPS 成分复杂，随着藻种和培养条件的不同而变化。一方面，EPS可作为水化膜使胞外酶更靠近藻细胞，进而对抗生素进行代谢[1]；另一方面，EPS可作为表面活性剂或乳化剂增强抗生素的生物利用率[1,54]，以供后续微藻将胞外的抗生素通过细胞壁运输到微藻细胞内，在胞内对抗生素进行分解。目前，胞外降解的研究较少。

3.3 生物累积

生物累积是微藻将抗生素储存在体内，但是并未降解。一种是微藻缺乏足够降解该抗生素的酶，一种是酶对该抗生素的降解能力有限，导致抗生素在微藻胞内累积。生物累积在抗生素去除中的贡献一般较小，比如磺胺美拉嗪、磺胺甲唑及磺胺单甲氧嘧啶在雨生红球藻、羊角月牙藻和四尾栅藻中生物累积的贡献只占2%～3%，而在小球藻中也只有4%～5%[50]。抗生素在微藻内的生物累积也与其疏水性有关，如果疏水性用n-正庚醇-水分配系数（lgKow）表示，抗生素的lgKow越高，生物表面吸附和生物累积的趋势越大[50,55]。生物累积和生物表面吸附也可以用不同方法定量分析。生物累积和生物吸附主要有以下区别：①生物累积发生在微藻细胞内，而生物表面吸附发生在胞外[55]；②活细胞才能进行生物累积[48]。生物累积是微藻去除亲脂性药物的一个重要的机制，但是不同的藻种间存在差异。某些抗生素在细胞内的积聚可能引起活性氧（ROS）的产生，ROS对微藻细胞有双重影响，当ROS 在常规水平的情况下，能作为信号分子控制代谢，若ROS 过量，则会对微藻合成的色素、蛋白质、脂类或DNA 造成损害最终导致微藻死亡[1]，所以，微藻只能处理一定浓度的抗生素。

3.4 光合降解

光合降解包括直接光合降解和间接光合降解。直接光合降解是某些抗生素由于暴露在光下而发生的直接分解，而间接光合降解是由于光存在而使微藻产生一些活性物质，进而对抗生素进行降解[55]。Norvill 等[56]用微藻去除废水中四环素，监测四环素在1天（光暗周期）中浓度变化，发现间接光合降解占优势地位。Bai 等[57]处理含二氯苯氧氯酚（TCS）废水，发现在不加藻的情况下，7天内直接光合降解占比达到了63%～100%。一般来说，光在生物反应器中存在较强的光衰减。因此，光合降解在空间上随着光衰减逐步降低。光合降解与抗生素种类、光生物反应器的结构和光照时间等密切相关。环丙沙星存在光合降解，白天以光合降解为主，夜晚以生物表面吸附为主[58]。对环丙沙星来说，微藻快速生长获得足够的生物量，通过生物表面吸附去除环丙沙星。

3.5 水解和挥发

部分抗生素在水中不稳定，会产生水解。考察其水解效果可以更准确地评价微藻在抗生素去除中的作用。无论是水解还是挥发，都和抗生素本身的物化性质和操作条件（如温度、搅拌、pH 等）有关[48,55]。

微藻去除抗生素是一个复杂的过程，经常是多种机制都在发挥作用（见图2）。不同的藻种去除特定抗生素的机制也存在差异。小球藻去除7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的能力优于衣藻和麦可属藻[59]。其中，小球藻表面吸附量最大可达4.74mg/g，光解和水解在抗生素的去除中发挥了重要作用，无光、无CO2的条件下7-ACA的去除率在75%。磺胺甲唑几乎没有水解和光解，主要靠衣藻的降解，水解、光解和生物降解在去除四环素中约各占50%、20%和30%[52]。微藻去除抗生素的机制研究需要从分子和生化等层面综合分析，已经初步探索了甲氧苄啶和磺胺甲唑等抗生素的部分降解途径，但是对抗生素在微藻体内的完整降解途径还所知甚少[50,60]。生物表面吸附是较为快速的过程（小于1h），而生物累积和降解消耗时间较长[50,61]。这就需要考察微藻去除抗生素的动力学过程中各种机制的贡献。

图2 阿莫西林降解机制

4 微藻处理的工艺条件

利用微藻去除抗生素，需要根据抗生素的种类及浓度选择适合的藻种，并优化培养条件。

4.1 藻种的选择

总体来说，选择的藻种要能耐受含抗生素废水的环境胁迫，并快速生长。微藻的快速生长将获得足够的生物量进行抗生素的吸附、降解和累积。抗生素的去除有高度的藻种特异性。Liu 等[62]认为磺胺类、大环内酯类抗生素比四环素类及喹诺酮类抗生素更难去除；陈辉等[63]认为大环内脂类抗生素作为蛋白质抑制剂对真核微藻有更强的毒性作用；Song 等[64]用小球藻去除氯霉素衍生物——甲砜霉素，低浓度（46mg/L）去除效果最佳，去除效率为95%，并且主要是生物降解的贡献；高浓度（159mg/L）去除效率仅为75%，其中生物表面吸附和生物累积的贡献小于3%。Xie等[52]发现衣藻可以完全去除四环素，但是对低浓度磺胺甲唑（1mg/L）的去除率也仅有20%（见表2）。绿藻和蓝藻在水生态食物链中是重要的一部分。已经报道的可以去除抗生素的藻种包括小球藻（Chlorellasp.）、栅藻（Scenedesmussp.）、微拟球藻（Nannochlorissp.）、衣藻（Chlamydomonassp.）、聚球藻（Synechococcussp.）等（见表2）。相对绿藻来说，多数蓝藻不能耐受高浓度抗生素[69]，所以蓝藻去除抗生素的研究较少。

4.2 培养条件的影响

抗生素去除与微藻生长密切相关。微藻的生长会受到光暗循环、pH、光强、CO2浓度、盐度、搅拌速率、营养物添加以及水力停留时间等条件的影响。因此，这些因素也影响了微藻去除抗生素的效率。实验室内优化的培养条件，在室外大规模培养及含抗生素废水处理中未必适合。因为包括温度、光强等这些关键培养条件在一天中也会产生较大的变化。需要在中试中调整相关参数，为大规模反应器参考。在室外培养过程中，水力停留时间是关键的参数之一[43]。对100μg/L 四环素，水力停留时间4天去除效率超过93%，如果水力停留时间增加到7 天，去除效率可以超过99%[56]。即使水力停留时间分别为1 天或2 天，小球藻在生物膜-膜光生物反应器中去除磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶以及磺胺甲唑的效率在50%～82.1%[70]。四环素等在有光和无光条件的去除机制是不同的[54]，光暗循环也是影响微藻生长的重要培养条件之一，需要对光暗循环进行优化。

光生物反应器结构决定了微藻规模化培养及抗生素去除的效率。综合考虑废水在实际应用情况中的问题，如总体成本、废水量及建造问题等，开放式培养系统仍是微藻培养和废水处理的主流选择[71-72]。目前也有一些室外光生物反应器去除废水中抗生素的报道。Norvil等[56]用180L室外高效藻类塘（HRAP）处理含四环素的生活废水，虽然环境最高温度在25.9～32.4℃之间变化，采取水力停留时间7 天或4 天，分4 个阶段从5 月稳定运行到9月，可将废水中100μg/L 四环素降低到10μg/L 以下。López-Serna 等[43]用两个3L 开放式光合反应器处理兽用抗生素，对强力霉素和土霉素可以达到93%～95%的去除率，但是无法去除达诺沙星、磺胺二甲嘧啶和马博沙星。Hom-Diaz 等[58]用1L 的HRAP处理在生活废水中添加的环丙沙星，当环丙沙星浓度达到2mg/L时，也可以部分去除。如果用1200L多管式反应器处理卫生间废水，在9～12月间采用8 天或12 天的水力停留时间，分两个阶段运行，抗生素的去除效果见表3。还需要更多的室外中试数据，考察微藻去除含抗生素废水的技术可行性和长期操作的稳定性，并进行经济分析。

表2 微藻处理抗生素的参数及去除效果

微藻生长需要氮磷等营养物质，除了在BG11等培养基中的探索性实验，也有部分用含抗生素废水或用废水出水+抗生素的研究（见表3）。微藻处理含抗生素废水的研究还需要和其他过程集成，将废水中的主要指标降低到可以被微藻利用的水平，使微藻既去除氮、磷等污染物，也去除抗生素。

表3 微藻处理抗生素的参数及去除效果

5 结语

微藻生物技术是处理含抗生素废水的可能途径之一。光合自养型的微藻能利用废水中的污染物，能量来源于太阳光；同时，微藻在降解抗生素等污染物的同时还能产生生物燃料等高附加值产品。然而，用微藻去除抗生素的研究还处于初期阶段，存在如下问题：①微藻对实际废水中的抗生素还无法做到完全去除；②对抗生素降解过程中的中间产物尚不明了；③缺乏规模化应用及经济性分析。原因在于实际含抗生素废水成分复杂与水质波动。我国幅员辽阔，气候和水资源差异显著。温度和水资源等条件制约着微藻培养和含抗生素废水处理的技术经济性。

针对微藻处理含抗生素废水的上述问题，还需要开展以下工作。

（1）可以筛选对目标抗生素去除能力强的微藻，结合化学、物理和生物方法，发挥各自优势，达到去除要求。生物法中可以通过菌藻协同作用提高抗生素降解效率。需要根据抗生素降解需要，选择合适的藻种和菌种，优化降解条件，明确菌藻之间的相互作用关系。

（2）通过组学数据等探索抗生素降解机制，综合分析包括水解和光合降解在内的抗生素降解产物。相对大肠杆菌和酿酒酵母等工业微生物，微藻的基因组信息还不多。需要结合基因组、转录组、蛋白质及代谢组等组学数据精准分析微藻中的抗生素降解途径，确认关键降解酶的作用及其分子机制，对有潜在危害的化合物进行监控和去除。

（3）针对实际废水，选择工艺并优化条件。目前的研究多数是在实验室内进行，以去除单一抗生素为主。环境水体中抗生素的种类多，复合抗生素对藻的抑制作用可能更加明显。需要合理选择操作模式、反应器形式和培养条件。一般来说，面源污染中抗生素浓度低，但是微藻培养时间长，需要解决其水力停留时间问题。点源污染中抗生素浓度较高。先从较好处理的含抗生素农业废水等做起，积累中试数据，为进一步的规模化应用打下基础。