香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用及正交优化

张丹 颜梦秋 张美彦 谭琦 宋春艳 尚晓冬

摘要：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种高效鉴定微衛星分子标记的方法，广泛应用于种质鉴定、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种等研究中。该方法由于操作繁琐，目前在食用菌领域的应用尚不广泛。以香菇为研究对象，建立变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测流程，并利用正交试验对检测流程中涉及的加样缓冲液与PCR反应液的体积比、95 ℃变性时间、置于冰上冷却时间、银染时间、银染后胶板去离子水洗时间等5个操作节点进行优化。结果表明，加样缓冲液与PCR反应液体积比为1 ∶2，95 ℃变性2～5 min，置于冰上冷却15～20 min，银染7 min，银染后胶板用去离子水洗5～10 s是正交试验的较优处理组合。试验建立了香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作规程，该操作规程具有成本低、效率高、易批量化操作等优点，对其他食用菌微卫星标记的应用具有重要的参考价值。

关键词：香菇;变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;微卫星标记;正交试验设计;银染试验

中图分类号：S646.1+20.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）05-0057-05

微卫星标记别称简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）标记是目前普遍使用的分子遗传学标记，具有多态性高、共显性、检测重复性好、基因组中广泛分布等优点。近年来，随着全基因组测序技术的不断发展，SSR标记已广泛应用于动植物遗传图谱的构建、数量性状座位（quantitative trait locus，简称QTL）定位、分子遗传多样性等研究。SSR标记扩增产物的检测方法主要有荧光标记引物测序法、同位素标记引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法等，其中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染检测法被认为是精度最好的鉴定方法。

在香菇分子遗传学研究中，SSR标记已应用于菌种真实性鉴定、遗传图谱构建以及遗传多样性分析等研究中。已有的文献报道表明，目前香菇中SSR标记的检测多采用琼脂糖凝胶电泳法或是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，有关变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法的报道较少。为进一步推动该方法在食用菌领域的应用，本研究拟采用正交设计对现有变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测流程进行优化，以期建立一套高效、低成本、易批量化实践的香菇SSR标记操作规程，同时为其他食用菌SSR标记的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年3月在上海市农业科学院食用菌研究所开展，供试香菇菌株为国内常用栽培品种，共24株（表1），由上海市农业科学院食用菌研究所育种室提供。通过十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，简称CTAB）法[10]提取香菇菌丝体的全基因组DNA。

1.2 PCR扩增体系和程序

选用的SSR引物根据香菇L135菌株的全基因组序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息见表2。

PCR反应使用Mycycler Thermal Cycler （Bio-Rad，USA） PCR仪，反应体系为20 μL，包括2 μL 10×Reaction buffer （Promega，without Mg2+），2 μL MgCl2 （Promega，25 mmol/L），0.4 μL dNTP（10 mmol/L），0.2 μL Taq聚合酶 （5 U/μL，Promega公司产品），2 μL 模板DNA （50 ng/μL），正向和反向引物各1 μL （10 μmol/L），以及 11.4 μL ddH2O。

PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 电泳

电泳仪型号为DYY-12（北京六一仪器厂），电泳槽型号为DYCZ-20E（北京六一仪器厂），玻璃胶板尺寸为48 cm×32 cm，采用体积浓度为6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增片段，采用稳压为1 000 V，电泳时间为50 min。DNA Marker 为DL500（TaKaRa 公司，日本）。

1.4 样品的变性处理

在电泳前须将PCR扩增产物进行变性处理，具体方法为将扩增产物与点样缓冲液按照一定比例进行混合。采用95 ℃高温处理打开DNA双链，之后迅速置于冰上冷却，使DNA保持单链状态。

1.5 银染及显色

试验采用银染及强碱法显色，具体流程为 （1） 电泳结束后切断电源，取下胶板，将附着凝胶的玻璃板放入装有去离子水的塑料盘中，快速用去离子水漂洗1次。（2） 银染：将胶板放入1 000 mL质量浓度为0.1%的AgNO3银染液中浸泡适当时间，之后用去离子水漂洗1次。（3） 显色：将银染后的胶板放入1 000 mL的显色液（质量浓度为1.6%的无水NaOH和体积浓度为0.5%的甲醛）中进行显色。

1.6 正交试验设计

经反复实践，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳流程有5个操作节点需优化改良，其中PCR扩增产物的变性有3个节点，即点样缓冲液添加量、高温（95 ℃）处理时间、变性产物在冰上冷却时间;银染和显色过程中有2个节点，即银染时间和银染后胶板去离子水漂洗时间。因此，试验采用L16（45）正交设计对上述5个节点进行优化改良，试验的因子设置为加样缓冲液与PCR反应液的体积比、95 ℃变性时间（min）、变性产物冰上冷却时间（min）、银染时间（min）、银染后去离子水漂洗时间（s）。具体试验设计见表3。

1.7 拍照统计与胶板质量评价

将银染显色后的玻璃胶板晾干后置于白炽灯箱上，对不同处理的胶板进行比较评价，使用数码相机拍照保存。

采用3个评价指标对各处理的胶板质量进行评价。3个指标分别为胶板整体清晰度、胶板背景色、产物条带和DNA marker的清晰度，胶板整体清晰度可分为模糊、一般、清晰等3个等级;胶板背景色分为深、一般、浅3个等级;产物条带和DNA marker的清晰度分为3个等级，即模糊、一般、清晰。上述3个指标各等级依次赋予1、2、3分的得分，得分越高效果越好。评价以白炽灯箱为唯一背景光源，采用人眼观测投票打分的方式进行，参与测评共34人，以出现次数最多的得分为该处理胶板质量指标的最终评分。各处理的胶板质量评分情况见表3。

2 结果与分析

2.1 正交试验各处理电泳及银染显色效果的比较

正交试验的极差分析结果可以阐明各因素不同水平对胶板质量的影响，同时也可以挖掘出重要的影响因子。表4中k表示表3中各因素同一水平对应胶板质量评分的平均值。极差（R）是各水平的平均值中最大值与最小值的差值。极差大说明此因素的不同水平产生的评分差异较大，重要性也越高。由表4可知，对胶板整体清晰度指标而言，最重要的影响因子为银染时间，其极差为2。胶板整体清晰度的平均值随着银染时间的增加呈增大趋势，说明银染时间与胶板整体清晰度成正比。

胶板背景色评分的极差分析结果表明，银染时间越短，银染后漂洗的时间越长，胶板背景颜色越浅。扩增产物条带和DNA marker条带清晰度评分的极差分析结果表明，银染时间和反应液与缓冲液的体积比对条带清晰度有较大影响，银染时间越长条带的清晰度越高;缓冲液与反应液的体积比为 1 ∶2 时条带清晰度最好。

2.2 正交试验各处理的时效性分析

正交试验中有4个涉及时效性的因素，其中高温（95 ℃）变性时间设置2、5、8、11 min等4个水平。试验结果表明，变性时间在2～11 min的范围内均可检测出目标条带，从提高试验效率以及节能降耗的角度考虑，变性时间设置为2～5 min较为合理。

冰上冷却时间设置5、10、15、20 min等4个水平，结果表明，冷却时间在5～20 min的范围内均可检测出目标条带，并没有出现随着时间的延長扩增产物复性现象（单链DNA变为双链状态）。在实际操作中，扩增产物的变性可在胶板预电泳（将胶板接通电源进行预热）之前进行，预电泳10～15 min后再进行上样有利于提高扩增产物在胶板中的整齐度，因此冰上冷却时间较为合适的选择为15～20 min。

银染时间设置2、7、12、17 min等4个水平。正交分析的结果表明，银染时间与胶板的整体清晰度以及扩增条带的清晰度呈正比，但与胶板背景色成反比。比较银染时间各水平的胶板整体清晰度得分可以发现，2 min处理的平均得分为1.00分，7 min 处理的平均得分为2.50分，12 min处理的平均得分为275分，17 min处理的平均得分为3.00分。综合胶板清晰度得分和时间成本，银染7 min较为合理。

银染后用去离子水漂洗时间设置0、5、10、15 s等 4个水平，极差分析结果表明，银染后使用去离子水漂洗胶板可降低背景颜色深度。在实际操作中，没有经去离子水漂洗的胶板放入显色液中时，胶板表面残留的AgNO3在显色液中会产生大量黑色沉淀物，其附着在胶板上使胶片背景色加深。同时较多的黑色沉淀物也会影响显色液的使用效率（1 d内进行多次银染时，显色液可重复使用）。而用去离子水漂洗时间过久（超过15 s），容易导致胶体在强碱显色液中从玻璃板上脱落，致使整个试验失败。综合考虑，银染后用去离子水浸泡胶板5～10 s效果较好。

综上所述，95 ℃变性2～5 min，置于冰上冷却15～20 min，银染7 min，银染后胶板用去离子水洗 5～10 s，是试验的较优处理组合。

3 结论与讨论

SSR标记稳定性好、多态性高且广泛分布于基因组，目前已应用于遗传多样性分析、连锁图谱构建以及分子标记辅助育种等研究[11]。食用菌中SSR标记的应用较晚，肖扬等最早在香菇上建立了 SSR-PCR 技术体系，并对种质资源进行了遗传多样性分析，该研究采用琼脂糖凝胶电泳法检测了SSR标记的扩增产物[7]。由于SSR标记的扩增产物分子量小，常规的琼脂糖电泳并不能完全检测出SSR标记的多态性，大规模应用SSR标记仍需使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测。

关于聚丙烯酰胺凝胶电泳及其染色方法的应用及改良在动植物中有较多报道，曲鲁江等比较了鸡基因组中SSR-PCR产物的变性与非变性聚丙烯酰胺-银染检测方法，发现变性聚丙烯酰胺凝胶及银染方法检测的条带较清晰、易于鉴定[4]。李建武等通过对不同染色方法的比较，在马铃薯上建立了SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶的快速银染方法[12]。王爱听等在玉米上对变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较，认为卫星扩增产物在二者上的电泳结果存在差异[13]。在变性胶中微卫星扩增产物目的条带清晰，易于鉴定;在非变性凝胶中表现有较多的非特异性条带。李立群等在小麦上对SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行了改进，提高了大规模SSR分子标记分析的工作效率[14]。王伟等对玉米SSR标记检测体系进行了优化，检测了贵州51份玉米杂交种的遗传多样性，并建立了玉米SSR标记技术操作规程[15]。

本研究在参考动植物中前人研究的基础上，建立香菇SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶检测流程，同时结合香菇SSR-PCR产物检测的自身特点，采用正交试验对检测流程中涉及的加样缓冲液与PCR反应液的体积比、95 ℃变性时间、置于冰上冷却时间、银染时间、银染后胶板去离子水洗时间等5个操作节点进行优化，结果表明，加样缓冲液与PCR反应液的体积比为1 ∶2，95 ℃变性时间2～5 min，置于冰上冷却15～20 min，银染7 min，银染后胶板用去离子水洗5～10 s，是正交试验的较优处理组合。

利用改良后的香菇SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳操作流程，笔者进一步选取6对SSR标记引物检测了24份常用香菇菌种的扩增产物。结果表明，该流程可以高效地检测出香菇基因组的SSR标记（图1），可应用于香菇遗传研究领域。优化后的操作流程可为其他大型真菌SSR标记的应用提供参考。

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