海藻酸钠成膜基质奶牛乳头药浴液研制及临床应用

侯慧君，张 欣，徐承倩，付旭彬，李建军，孙英峰*

(1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津瑞普生物技术股份有限公司 ，天津 300300)

奶牛乳腺炎是困扰奶牛养殖业发展的重要疾病之一，严重影响奶牛业的健康发展[1-2]。据报道，该病相关病原已达150多种以上，主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及无乳链球菌。目前，奶牛乳房炎的治疗主要包括全身及乳房局部的抗感染治疗，但全身用药治疗时乳房局部很难达到杀菌有效浓度，局部用药极易引起乳制品中抗生素药物残留和超标。因此，科学有效的乳头药浴消毒是预防乳腺炎的一个重要环节，能够有效降低乳房炎的发生率、减少经济损失、保证原奶品质[3]。

目前，奶牛成膜性乳头药浴液较多，多数采用聚乙烯醇(PVA)作为药浴液成膜基质，而世界卫生组织国际癌症研究机构于2017年10月27日公布的致癌物清单，将PVA列在3类致癌物清单中，因此从食品安全角度出发，迫切需要寻找安全无毒成膜基质替代品。海藻酸钠(ALG)又称海藻胶、褐藻酸钠或海带胶，是一种天然多糖，广泛应用于食品可食用保鲜剂以及制药片剂的粘合剂领域。ALG属于无毒食品，早在1938年就已被收入美国药典，1963年收入英国药典，2010年中国药典首次收录海藻酸钠为药用辅料，因具有较好的稳定性、溶解性、粘性和安全性等特点，现已经被广泛用于食品工业和医药领域[4-6]，但尚未见以海藻酸钠成膜基质乳头药浴液用于预防和治疗奶牛乳房炎的报道。本试验考察海藻酸奶牛乳头药浴成膜基质可行性，并先后进行安全性、有效性、保质期及临床有效性试验研究，为奶牛乳腺炎防治兽药新剂型的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌，由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 主要试剂与设备

海藻酸钠粘度(10 g/L，20 ℃)(Pa.s)≥0.02，购自北京索莱宝生物技术公司，聚维酮碘溶液、硫代硫酸钠、琼脂培养基购自天津六合生物技术公司。超净台(江苏通净)、灭菌高压锅(山东新华医疗器械股份有限公司)、恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)、摇床(上海世平实验设备有限公司)、天平(奥豪斯仪器常州有限公司)、磁力搅拌仪(天津欧诺仪器仪表有限公司)、低速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司)、移液枪、离心管。

1.3 试验动物

清洁级家兔，购自北京通威实验动物公司。

1.4 药浴液成膜性试验

配制浓度为1%海藻酸钠溶液，加入稳定剂氯化钙(终浓度0.034 g/100 mL)[7]及护肤成分甘油(终浓度10%)，加入5 mL聚维酮碘溶液，制得药浴液。用塑料滴管模拟乳头，蘸取一定量药浴液置于通风且阳光散射处，计算成膜时间。

1.5 药浴液安全性试验

依据《中国兽药典》(2015)开展皮肤的刺激性安全试验。选择9只成年健康母兔进行皮肤敏感性试验，连续7 d，分别将聚维酮碘原液、药浴液和生理盐水分别抹于母兔的背部皮肤，进行观察。试验7 d后，切下背部皮肤，制作切片，观察病理变化。

1.6 药浴液有效性试验

按照《消毒技术规范》要求，采用杀菌率判定药浴液有效性。取标准菌种接种于LB肉汤培养基，细菌计数调整浓度量为1×108～5×108cfu/mL进行杀菌率试验。杀菌时间依次为30 s、5 min，采用硫代硫酸钠进行中和，细菌计数并计算杀菌率。

1.7 药浴液保质期试验

将制备好的成膜性乳头药浴液，在常温避光条件下保存，按照成膜性试验及有效性步骤，分别设定30 d、90 d、180 d成膜效果及杀菌率，评估保质期。

1.8 药浴液对比试验

购买市售某商品化聚乙烯醇(PVA)成膜基质的奶牛乳头药浴液，查看生产日期，选取日期相近成膜药浴液测定5 min时间节点杀菌率。

1.9 药浴液临床应用试验

选取天津武清区某奶牛养殖场，将本产品用于挤奶后药浴，观察成膜效果及牛场临床乳腺炎发病情况，并采用LMT法测定应用前后隐性乳腺炎发病比例，评估本产品临床应用效果。

2 结 果

2.1 药浴液成膜性结果

通过体外模拟成膜性试验可知，本试验研制的药浴液可以在室温自然环境条件情况下，约在5 min可以成单层薄膜，且韧性良好。

2.2 药浴液安全性结果

试验第1～2天，聚维酮碘原液组中家兔皮肤部位出现红色炎性反应并出现小疙瘩现象，第3天开始消退，海藻酸钠成膜药浴液和生理盐水对照组均无不良反应。显微病理切片结果显示聚维酮碘原液组皮下血管高度充血，海藻酸钠成膜性药浴液组仅表现轻微血管充血，与空白对照组无显著差异，具体见图1。

图1 海藻酸钠成膜性乳头药浴液对家兔皮肤刺激性显微切片结果(100×)Fig.1 Results of microscopic sectioning of rabbit skin by sodium alginate film-forming papillary bath (100×)

2.3 药浴液有效性结果

本试验研制的成膜性乳头药浴液在30 s、5 min的杀菌率详见表1。由表1可见，海藻酸钠成膜性药浴剂在30 s对奶牛乳腺炎常见病原菌杀菌率达99.99%以上。

表1 海藻酸钠成膜性药浴液对奶牛乳腺炎致病菌的杀菌效果Table 1 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis

2.4 药浴液保质期内不同时间杀菌效果

本试验研制的成膜性乳头药浴液在30 d、90 d、180 d时间，均可在5 min成膜，成膜效果良好，且表现出良好杀菌率(见表2)。

表2 海藻酸钠成膜性药浴液对奶牛乳腺炎致病菌的杀菌效果Table 2 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis %

2.5 药浴液杀菌效果

本试验研制的成膜性乳头药浴液与市售商品化聚乙烯醇(PVA)在5 min时杀菌对比试验结果见表3。由表3可见，海藻酸钠成膜性药液杀菌效果良好。

表3 海藻酸钠成膜性药浴液5 min杀菌效果Table 3 Comparison of sterilization of sodium alginate film-forming medicated bath with commercially available medicated bath %

2.6 药浴液临床应用结果

在天津武清区某奶牛养殖场，应用本试验研制的成膜性乳头药浴液后，其临床乳腺炎发病率由原来5%下降到2%，隐性乳腺炎发病率由原来的20%下降到8%(见表4)。本试验研制的成膜性乳头药浴液表现出良好的预防乳腺炎发病效果，具有较好临床应用前景。

表4 海藻酸钠成膜性药浴液临床应用效果评估Table 4 Evaluation of clinical application of sodium alginate film-forming medicated bath %

3 讨 论

奶牛乳腺炎是奶牛的常见病，发病原因较为复杂，其中环境性病原微生物是主要生物性因素，而挤奶厅奶牛乳头后药浴辅助控制是常用手段之一。目前市售的奶牛乳头挤后药浴液成膜基质多选用聚乙烯醇(PVA)，除医用级别外，其他级别的聚乙烯醇曾被世界卫生组织国际癌症研究机构列入三类致癌物质清单，因此，筛选出安全级别更高的成膜基质已经迫在眉睫。海藻酸钠具有无毒、可生物降解、良好生物相容性、缓释和控释等特点，主要作肉类制品保鲜可食用涂膜的主要原料[9]。因此，将海藻酸钠的成膜性和安全性应用于奶牛乳头药浴液成膜基质上，将大幅度提升药浴液的安全性。

目前市场上商品化奶牛乳头药浴液对奶牛乳腺皮肤组织有一定的损伤和刺激[10]。为研究本成膜药浴制剂对奶牛乳房皮肤的刺激性，本试验依据《中国兽药典》(2015)开展皮肤的刺激性安全试验。结果表明，聚维酮碘组家兔皮肤出现不同程度炎症反应，成膜药浴剂试验组未见明显可见病理变化。显微病理切片进一步证实药浴液组表现轻微血管充血现象，无组织坏死。说明本研究的成膜性药浴对动物皮肤无不良刺激，且组分中的润肤成分可很好地保护乳头。

据报道，链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引发我国奶牛场乳腺炎主要病原菌[11]。对奶牛乳腺炎常见致病菌的杀菌试验表明，本次研制成膜性乳头药浴液在30s时间节点均表现出不同程度的杀菌作用，其中对金黄色葡萄球菌杀菌率100%，无乳链球菌和大肠杆菌杀菌率达99.99%以上；且在180 d时同样表现出了良好的杀菌效果。成膜性乳头药浴液除了直接将附着于乳头部位的细菌杀死外，同时形成保护膜，发挥物理性屏障作用保护乳头，有效减少病原菌进入乳房的机会，从而降低乳腺炎的发生概率。该成膜性乳头药浴液制剂安全无刺激性，良好杀菌效果，具有很好的推广和应用前景。