多价流感疫苗及通用型流感疫苗的研究进展

谢青昕，刘艳红 综述，鲁卫东 审校

昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明650500

流行性感冒（简称流感）是一种病毒性传染性疾病，根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计，季节性流感每年在全球会造引起300 万～500 万例严重病例，导致30 万 ～50 万人死亡，实际数字可能更高［1］。流感病毒属于正黏病毒科，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）、丁（D）4 型。甲型流感病毒可感染多种不同物种，是导致季节性流感传播和致死的主要病原体；乙、丙型流感病毒变异较少［2-3］，丁型流感病毒主要感染牛。甲型流感病毒表面血凝素（haemagglutinin，HA）分为 18 种亚型，神经氨酸酶（neuraminidase，NA）有 9 种亚型［4］。乙型流感病毒分为两个谱系，即 Victoria 系（BV）和 Yamagata 系（BY）。

接种流感疫苗是目前预防流感最经济有效的方法。1942 年，对流感病毒疫苗进行大规模的研究证明，灭活流感疫苗可有效预防流感［5］。目前，使用较多的为三价及四价流感疫苗，三价流感疫苗包含2 种甲型流感病毒（H1N1 和 H3N2）和 1 种乙型流感病毒（BV）；四价流感疫苗是在三价流感疫苗的基础上增加了 1 种乙型流感病毒（BY）［6］。

当流感疫苗株与当年实际传播的病毒株匹配时，多价流感疫苗有效率可达70% ～90%，但老年人及免疫低下人群的有效率较低［7］；若疫苗株与当年流感病毒匹配度较低，其功效会降低［8］。同时，生产与当年流感病毒亚型相匹配的多价流感疫苗需耗时几个月，还需投入较大的财力及劳动力［9］。目前，正在开发的通用流感疫苗（universal influenza vaccine）采用多种创新技术，如在疫苗中添加新型佐剂提高疫苗免疫原性、寻找可扩大免疫范围的抗原靶点、利用细胞免疫等，使其更有效安全。

1 多价流感疫苗的研究进展

目前，已获批上市的流感疫苗主要分为流感灭活疫苗（inactived influenza vaccine，IIV）及流感减毒活疫苗（live attenuated influenza virus vaccine，LAIV）两类。LAIV 是使流感病毒丧失大部分致病性，但仍可刺激机体产生免疫原性的一类疫苗。LAIV 可通过鼻部给药，与自然感染的方式较接近，不仅可诱导强烈的抗体反应，还可诱导细胞免疫［10］及局部黏膜免疫［11］。儿童对灭活疫苗的免疫原性较低，LAIV可能更适合保护这类人群［12］。我国现批准上市的流感疫苗有三价灭活流感疫苗（inactived influenza vaccine 3，IIV3）和四价灭活流感疫苗（live attenuated influenza virus vaccine 4，IIV4）［13］，当前使用的 IIV3包括裂解疫苗与亚单位疫苗两种类型，IIV4 均为裂解疫苗。

1.1 LAIV 有研究对 1 314 名儿童（15 ～ 74 个月）进行了一项为期2 年的随机、安慰剂的对照试验，结果证明，LAIV 对免疫易感儿童有较好的预防效果［14］。另一项随机、双盲、安慰剂对照针对65 岁以上的社区居民流动成年人的试验表明，LAIV 的整体有效率为42%［15］。2003 年，美国首次批准使用一价、二价及三价流感减毒活疫苗（LAIV3）；2013 年批准可接种四价减毒活疫苗（LAIV4）。虽然LAIV 在多年研究中在成人和儿童中均具有良好的耐受性，但部分小于2 岁的儿童接种LAIV 后出现了增加哮喘的倾向，机制尚未明确，因此不建议小于3 岁的婴幼儿接种LAIV。

1.2 IIV

1.2.1 IIV3 最早生产使用的IIV3 是1976 年法国上市的Vaxigrip，经长时间的使用证实，IIV3 具有良好的有效性和安全性［16］。2009 年，美国食品药品监督管理局（the US Food and Drug Administration，FDA）批准了高剂量注射用IIV3，该疫苗血凝素含量是普通疫苗的 4 倍（60 μg ／ mL），可用于 65 及 65 岁以上人群，研究证明，与标准剂量比较，高剂量IIV3 对65岁以上的老年人保护性更强，不良反应未增多［17］。疫苗添加佐剂可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，降低疫苗使用剂量，MF59 是第一种被许可用作人类疫苗佐剂的水包油乳液，可通过多种机制增强疫苗的免疫反应。研究发现，与非佐剂疫苗比较，三价MF59 佐剂季节性流感疫苗对老年人可诱导更高的免疫反应，并可获得针对不同型别流感病毒株的交叉免疫反应［18］。

1.2.2 IIV4 由于IIV3 中仅包含1 种乙型流感病毒株，其对另 1 种乙型谱系（BY）的保护能力较弱［19］，IIV4 增加了乙型谱系（BY），实验证实，该疫苗具有良好的有效性和安全性［20］，有研究表明，IIV4 的免疫原性不低于IIV3，安全性也相当，且扩大了保护范围［21-22］。IIV4 和LAIV 大部分均是采用鸡胚制备而成，需在季节性流感来临前6 个月对毒株进行预测和选择，鸡蛋过敏的人群不适于接种该类疫苗。2016 年，美国批准上市的季节性重组四价流感疫苗是首个采用昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产的流感疫苗［23］，实验证明，该疫苗的免疫原性与IIV4 相当［24］。BAXAK 等［25］发现，口服低剂量（1 ×106pfu）的重组流感疫苗，可在2 次免疫后诱导全身性和黏膜性IgG 和IgA 抗体应答，从而提供全面保护，但重组流感疫苗的成本较其他季节性流感疫苗约高40%，在一定程度上限制了其使用。

2 通用流感疫苗的研究进展

IIV3 和IIV4 常用作季节性流感疫苗，虽具有使用安全，便于保存等优点，但这类疫苗在相关研究中发现，其在特定人群（65 岁及65 岁以上老年人、孕妇、24 周内的婴儿）中免疫效果低于健康成年人［26］。因此，研发一种可对人体提供广泛保护，能够应对季节性流感与大流行性流感的疫苗成为研究热点。2017 年，美国国家过敏和传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID）召开研讨会［27］，初步制定了通用流感疫苗的标准：通用流感疫苗至少应对75%的流感症状有效；能预防Ⅰ型及Ⅱ型甲型流感病毒（乙型流感是次要目标）和免疫效果应需至少持续1 年；最好可保证疫苗能持续多个季节对接种者进行保护。目前，处于研发中的通用型流感疫苗见表1。

2.1 基于能引起广泛反应抗原的通用型流感疫苗目前使用的病毒毒株具有较强的特异性，缺乏广谱性，因此，寻找一种能全面有效的激发免疫系统，可引发广泛反应的抗原是通用流感疫苗研究的热点之一。流感病毒的基因组在8 个RNA 片段上编码了11 种蛋白质，包括 HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1-F2 和PB2，这些蛋白质在禽类和人类病毒分离株中变异程度相对较保守。近年发现，M2［36］、NA［37］和 HA 的茎秆［38］等能诱导更广泛的保护性免疫应答。

表1 2019 — 2020 年研发中的通用流感疫苗Tab.1 Universal influenza vaccines in development from 2019 to 2020

2.1.1 基于M2 的通用型流感疫苗 M2 蛋白是甲型流感病毒上的一种膜蛋白，具有离子通道活性，M2离子通道是病毒感染细胞所必须的重要组件。甲型流感病毒中，M2 的N-末端9 个氨基酸是保守的［39］。由于M2 蛋白在甲型流感病毒中具有高度保守性，可诱导针对不同流感病毒的交叉保护［40］。自然感染情况下，不会诱导机体产生保护性抗体，但将其单独分离用作免疫原时，在某些条件下可引发保护性抗体。研究发现，串联表达多个M2 序列可提高免疫原性［41］。M2 以类病毒颗粒（virus-like par-ticles，VLPs）形式配伍CTA1-DD 佐剂制备的疫苗经滴鼻免疫后可增强其免疫原性［28］。

目前已有多个基于M2 的疫苗进入临床试验阶段。使用 M2e-Hbc VLPs ／ CTA1-DD（ACAM-FLU-A）疫苗进行了Ⅰ期临床试验，发现该疫苗耐受性良好，无严重副作用，多数受试者均能对M2 的免疫应答［42］。另一种候选疫苗STF2.4 × M2（在临床试验中称为VAX102）是M2 与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白进行融合表达，该疫苗也完成了Ⅰ期临床试验［43］，结果表明，第2 次免疫后96%受试者检测到了M2 特异性IgG 抗体。多数基于M2 的候选疫苗经实验证实，可降低动物模型的发病率，具有安全性高、副作用小等优点，但通过M2 疫苗诱导出的抗体是否对所有甲型流感病毒亚型产生保护作用需进一步研究。

2.1.2 基于HA 的通用型流感疫苗 HA 是流感病毒颗粒上的主要表面蛋白，可与靶细胞受体唾液酸结合。HA 是由球状头部和茎区域组成的3 种HA 单体三聚体，受体结合点存在于在球状头部，是蛋白质的可变性最高区域，在不同亚型间的变化较大。HA 球状头部存在一些保守区域，球状头部空间位置较杆部更易被抗体接近。有研究显示，部分抗体可与高度变异的HA 球状头部受体结合点中保守区域相结合，如C05 可识别结合位点中的保守区域，中和不同流感亚型菌株［44］，该结果为靶向HA 球状头部的通用流感疫苗提供了线索。BANGARU 等［45］发现，天然抗体FluA-20 可识别HA 头部一个易攻击的靶点，还可与大多数甲型流感病毒发生反应，抑制病毒在细胞间的传播。

HA 茎部免疫区域相对保守。目前，大部分基于HA 的通用流感疫苗的研发是将靶向HA 茎部作为研究重点［46］。在接种疫苗或是自然感染流感病毒时，HA 茎部常被其头部所阻碍，因此疫苗的设计需增加HA 茎部在宿主免疫系统中的暴露程度，如利用茎结构域中的某些短肽表位与载体蛋白结合，增加HA 茎部免疫暴露程度，帮助抗原呈递至茎部结构域中，增强免疫作用，WANG 等［47］研究表明，这种将短肽表位与载体蛋白结合的方法对H3 亚型具有较好的保护作用。LANG 等［48］发现，VH1-69 抗体 27F3 以独特的方向与HA 茎部结合，可引起广泛的抗原反应。

2.2 基于交叉保护性T 细胞反应的通用型流感疫苗与HA 比较，流感病毒的内部抗原在甲型流感的所有亚型和毒株中高度保守。NP 和基质蛋白1（M1）在被病毒感染的细胞中大量表达，T 细胞可杀死被病毒感染的细胞。ALTENBURG 等［49］发现，CD8+T 细胞可与多种甲型流感病毒发生反应，在感染甲型流感病毒后可诱导机体产生一定水平的保护性免疫，以抵抗其他亚型甲型流感病毒的攻击。QUIÑONESPARRA 等［50］发现，多次感染流感后，体内的 CD8+TRM 保护性细胞会进行累积，有助于再次感染流感时对机体进行保护，结果表明，通过使用作用于细胞毒性T 淋巴的疫苗唤醒机体T 细胞反应十分可行。

通过疫苗接种增强对流感保守抗原的T 细胞应答是目前许多通用型流感疫苗开发的基础。BiondVax公司的M-001 疫苗不含任何病毒，是一种肽疫苗，具有9 个高度保守的病毒表位，这些表位来自3 种不同的病毒蛋白，包括M1（衬在病毒包膜中的基质蛋白）、NP（包裹在病毒RNA 周围的核蛋白）和HA 头部的保守部分。目前M-001 疫苗正在进行Ⅲ期临床试验，前期试验已证实，该疫苗具有良好的安全性，疫苗的IgG 滴度最多可增加 50 倍［33］。SEEK 公司生产的多表位疫苗FLU-V，与Montanide ISA 51 佐剂一起使用，可诱导机体产生较好的免疫效果［34］。天然获得T 细胞介导针对流感的免疫力是短暂的，因此在确定由疫苗诱导的T 细胞免疫的持续时间仍需要进行深入研究，但通过疫苗诱导增强T 细胞的保护作用及用单一疫苗可预防所有甲型流感病毒的可能性使其成为流感疫苗研究的热点。

2.3 通用型流感疫苗的佐剂及接种方式 铝佐剂是较常用的人用疫苗佐剂，由于其存在可能会引起注射部位疼痛、肉芽肿、局部红斑等不良反应，因此，寻求更安全、有效的佐剂在疫苗研发中十分重要。CaPNP 佐剂可诱导多种病毒和细菌感染的体液免疫和细胞免疫，不会引起不良反应［51］。阳离子脂质体2，3-二油氧基丙基三甲基氯化铵（2，3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium，DOTAP）也是目前研究较多的佐剂之一，有研究发现，将DOTAP 作为佐剂应用于H5N1 流感疫苗中，可显著提高疫苗的免疫原性［52］。Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂可通过促进先天免疫反应进而诱导适应性免疫反应来提高疫苗效应，LAIV 通过滴鼻的方式模拟病毒自然感染模式，可诱导适应性免疫来提高免疫效力，TLR3 激动剂可通过滴鼻给药的方式刺激黏膜免疫，具有作为通用流感疫苗佐剂的潜力。

随着疫苗的发展，流感疫苗的使用方式也不局限于肌肉注射，微针及通过鼻黏膜免疫成为新的接种方式。微针可穿透皮肤角质层，使疫苗快速进入表皮和真皮，而皮肤中包含各种免疫细胞，因此通过微针导入疫苗也是一种有效的接种方式。有研究证实，将各种抗原形式如灭活的病毒、VLPs 等通过微针接种可提高免疫原性［53］。

3 小结与展望

流感仍对公众健康产生巨大威胁，注射疫苗是目前应对流感最有效的措施。目前，可通过添加佐剂刺激免疫原性、优化病毒株预测手段、对免疫力低下的人群采用注射高剂量疫苗等方式来提高多价流感疫苗的有效性。针对流感病毒变异较快，疫苗生产周期长及保护性不足等缺点，通用型流感疫苗显示出了广阔的前景。目前通用型流感疫苗的研究方向主要在流感病毒M2 蛋白、HA 的茎部及T 细胞反应等方向，部分通用型疫苗的研究已进入临床试验阶段，但仍存在改进的空间，如通用流感疫苗被要求对高风险人群（老年人、孕妇、肥胖者）也要有保护效力。另外，对通用流感疫苗引起广泛保护的病毒靶标作用机制也需进一步探索。随着制剂技术的提高及对流感病毒研究的深入，多价流感疫苗和通用流感疫苗均得到了快速发展，如对多价流感疫苗进行修饰改造，可提高多价流感疫苗的有效性，相信将来也可开发出广泛预防甲型、乙型流感的通用型疫苗。