弥漫大B细胞淋巴瘤中Prdx6的表达及其预后意义

刘 谦，袁 晟，刘 勇

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常见的类型之一。据国内一项大型多中心研究显示，DLBCL是我国人群中最常见的淋巴瘤类型，占所有淋巴瘤的33.27%[1]。氧化应激在肿瘤、炎症、创伤、缺血再灌注等很多疾病状态或病理状态下出现。有研究者应用一系列氧化应激标志物和抗氧化物酶首先证实了侵袭性霍奇金淋巴瘤中存在氧化应激现象[2]。而过氧化物酶(peroxiredoxin, Prdx)作为一类新发现的抗氧化酶蛋白家族，广泛存在于原核和真核生物中，对生物体内的活性氧具有重要清除作用[3]。Prdx6是Prdx家族中唯一属于1-半胱氨酸(1-cysteine, 1-Cys)亚类的成员，尽管其在蛋白构成上与家族其它成员具有同源性，但在功能特点上表现出明显的不同[4]。随着研究的深入，Prdx6在肿瘤尤其是淋巴瘤的发生、发展，以及在肿瘤侵袭过程中的作用也被不断发现[5-7]。因此，本实验采用免疫组化法检测Prdx6在DLBCL中的表达，探讨其与临床病理特征及患者预后之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集江西省人民医院2015～2017年诊断的286例DLBCL作为研究对象，根据病史、临床表现、影像学检查、实验室检查等进行临床资料分组。按照Hans分型将DLBCL分为生发中心(germinal center B-cell like, GCB)组和非生发中心(non-germinal center B-cell like, non-GCB)组。根据免疫组化BCL-2(≥50%)和C-MYC(≥40%)的表达情况，筛选出病例中的双表达。根据DLBCL类型分为特指型和非特指型，其中特指包括原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤(primary diffuse large B-cell lymphoma of CNS, PCNSL)、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤[primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma, PMBL]、EB病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤(EBV-positive diffuse large B-cell lymphoma, EBV+DLBCL)，富于T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤(T-cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma, THRLBCL)；以及弥漫大B细胞淋巴瘤，非特指型。同时，收集30例正常淋巴结作为对照。在有随访资料的124例患者中，死亡28例，随访时间1～57个月。

1.2 方法Prdx6兔抗人单克隆抗体(ab133348，Abcam公司，稀释度1 ∶300)。所有组织均使用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，行常规HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision两步法。

1.3 判定标准Prdx6阳性定位于细胞核和细胞质。阳性结果针对肿瘤细胞染色强度进行评估：(1)弱阳性(仅在40倍物镜下可见)；(2)中等强度阳性(在20倍物镜下可见)；(3)强阳性(在10倍物镜下可见)，且只有100%细胞显示强阳性才纳入强阳性组[7]。在临床和病理资料双盲条件下由两名病理学专家进行阅片评分。

1.4 统计学分析所有数据应用IBM SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用χ2检验分析Prdx6蛋白表达与临床病理特征的关系。生存率的统计采用Kaplan-Meier生存分析(组间比较采用Log-rank检验)和Cox多因素回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL与正常淋巴结中Prdx6的表达在286例DLBCL中，Prdx6阳性196例，在30例正常淋巴结中，Prdx6阳性9例。Prdx6在DLBCL中的表达高于正常淋巴结，差异有统计学意义(χ2=17.69，P<0.001，表1)。

表1 DLBCL及正常淋巴结中Prdx6的表达

2.2 DLBCL中Prdx6表达与临床病理特征的关系DLBCL中Prdx6表达与患者性别、年龄(<60岁和≥60岁)、有无B症状、LDH水平、Hans分型、有无双表达、肿瘤分期及组织学类型进行比较，其中Prdx6在Hans分型中的表达差异有统计学意义(χ2=21.771，P<0.001)；而在性别、年龄、有无B症状、LDH水平、有无双表达、肿瘤分期及组织学类型的表达差异均无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 Prdx6表达与DLBCL临床病理特征的关系

2.3 DLBCL中Prdx6表达强度与临床病理特征的关系在286例DLBCL中，Prdx6阴性90例(图1)；不同程度阳性196例，其中弱～中等阳性89例(图2)，占阳性病例的45.4%，强阳性107例(图3)，占阳性病例的54.6%。其中，Prdx6在具有B症状组和LDH升高组中的阳性程度差异有统计学意义(χ2=4.872，P=0.027；χ2=5.965，P=0.015)，而在患者性别、年龄、Hans分型、有无双表达、肿瘤分期及组织学类型的表达差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。

①②③图1 DLBCL中Prdx6阴性,EnVision两步法图2 DLBCL中Prdx6弱～中等阳性,EnVision两步法图3 DLBCL中Prdx6强阳性,EnVision两步法

图4 Prdx6表达与DLBCL患者生存的关系

表4 Cox多因素回归分析

2.4 生存分析124例有随访资料的DLBCL患者平均生存时间为46.3个月。按照Prdx6免疫组化表达强度划分，阴性、弱～中等阳性和强阳性病例分别为37、43、44例。在37例Prdx6阴性病例中，PCNSL.原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤；PMBL.原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤5例因疾病死亡，32例生存；43例Prdx6弱～中等阳性病例中，8例因疾病死亡，35例生存；44例Prdx6强阳性病例中，15例因疾病死亡，29例生存。Prdx6表达与预后分析显示，Prdx6阴性、弱～中等阳性和强阳性患者的生存差异有统计学意义(χ2=9.308，P=0.01)。进一步统计分析显示，Prdx6强阳性组患者预后比阴性组患者的预后差(χ2=6.998，P=0.008，图4)。Cox多因素回归模型分析显示，只有肿瘤分期(RR=3.412，95%CI=1.245～9.348，P=0.017，表4)是影响患者生存的危险因素。

3 讨论

DLBCL作为最常见的淋巴瘤，由于其具有侵袭性生物学行为，患者预后常常较差。虽然有研究针对免疫化学治疗和预后标志物筛选[8-9]，且在一定程度上能够延长部分DLBCL患者的生存期，并为后续治疗带来新希望，但仍会出现部分复发难治和耐药患者。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作为生物体内正常有氧代谢的产物，能在生理和病理过程中调节细胞内氧化还原反应。随着ROS大量产生，氧化应激也随之产生，并在肿瘤的发生、发展中起至关重要的作用[10-11]。Prdx是一类抗氧化酶蛋白家族，在生物体内对ROS的清除具有重要作用。在哺乳动物中发现Prdx家族有6个成员(1～6)，其同工酶可以出现在细胞核、细胞质、线粒体、溶酶体、内质PCNSL.原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤；PMBL.原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤；*Fisher确切概率法网和过氧化物酶体中[11]。根据Cys残基数目的不同，使得Prdx6的功能有别于家族其它5个成员[12]。随着研究的深入，发现Prdx6在部分肿瘤的转移和侵袭上具有一定作用，与尿激酶和受体激活途径、谷胱甘肽过氧化物酶的增加有一定关联[13-15]。然而，Prdx6在淋巴瘤中的生物学行为还处于未知状态[10]。

表3 Prdx6阳性强度与DLBCL临床病理特征的关系

本组结果显示，Prdx6在DLBCL中的表达显著高于正常淋巴结。近期Kari等[16]发现：Prdx6在正常人血清中的表达高于DLBCL，其研究中并未涉及Prdx6在正常淋巴结中的表达情况。因此，Prdx6在正常人血清中高表达与淋巴结中的低表达是否存在关系，有待更多研究加以证实。通过Hans分型将DLBCL分为GCB组和non-GCB组，统计结果显示Prdx6在non-GCB组中的表达明显高于GCB组，说明Prdx6表达可能与生发中心后来源的肿瘤细胞有关。另外，在Prdx6阳性病例中，出现B症状病例的阳性强度明显高于无B症状病例，提示Prdx6表达强度可能与DLBCL所引起的全身症状(如发热、盗汗、体重减轻和皮疹等)有关。LDH作为评价淋巴瘤预后的主要指标之一，对淋巴瘤的监测和评估具有重要作用，其同工酶LDH-5升高更是被认为与非霍奇金淋巴瘤的预后和转归有关[17]。本实验结果提示，在LDH升高病例中的Prdx6阳性强度高于LDH正常病例，说明LDH升高与Prdx6阳性强度有一定关系。

本实验主要目的是评估Prdx6异常表达与DLBCL预后的相关性，从生存分析结果中发现Prdx6阳性程度越高，患者预后越差。在具有随访资料的病例中，Prdx6阴性和弱～中等阳性组的病死率分别为13.5%和18.6%，而强阳性组的病死率为34.9%，差异有统计学意义。Prdx6阴性和弱～中等阳性组间的生存率虽然有一定差异，但差异无统计学意义。另外，Kuusisto等[7]研究发现Prdx6在DLBCL反应性T细胞胞质中强阳性，患者预后会更好，提示可能是一种自身保护作用所致。

有研究证实，Fas/FasL凋亡途径是B细胞淋巴瘤发生的重要机制[18-19]，一旦Fas/FasL凋亡途径不能正常发生，就会导致B细胞大量增殖，最终形成B细胞淋巴瘤。一些拮抗Fas/FasL凋亡途径的分子通过抑制Caspases活性来阻断凋亡通路[20-21]，其中Caspase-8是凋亡信号通路的启动型Caspase，有研究已证实Prdx6是Caspase-8活性的负性调节因子[22]。那么，在DLBCL的发生过程中，Prdx6表达是否通过拮抗Fas/FasL途径而发挥作用，将有待我们进一步研究证实。