侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因突变与复发的相关性

陈修文，罗森源，汤显斌，王铁延，王 莉，黄育刚

侵袭性纤维瘤病又名韧带样型纤维瘤病或韧带样瘤，是一种发生于筋膜、肌腱膜或深部软组织的纤维性肿瘤，由纤维母细胞和肌纤维母细胞过度增生形成。目前认为该病为中间性肿瘤，由于肿瘤周围界限不清，常向周围邻近组织浸润性生长，不易切除干净，极易复发[1]。已有文献报道[2]，β-catenin蛋白核阳性和CTNNB1基因突变可用于侵袭性纤维瘤病与其它梭形细胞病变的辅助鉴别诊断，而两者与侵袭性纤维瘤病局部复发的关系在国内少见报道。本实验收集32例CTNNB1突变阳性侵袭性纤维瘤病，分析β-catenin蛋白表达和CTNNB1分子病理改变情况，探讨其与侵袭性纤维瘤病局部复发的联系，为临床评估该疾病复发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年～2019年十堰市太和医院病理科确诊的侵袭性纤维瘤病32例，其中复发病例只纳入第1次术后样本。纳入标准：(1)病灶组织病理学证实为相应的病理类型；(2)所有病例均进行CTNNB1基因突变检测证实为突变阳性；(3)无其他恶性肿瘤病史。排除标准：(1)只有细胞病理学(如穿刺细胞学)诊断依据；(2)临床资料不全。所用样本均有至少1名高年资病理医师复片，同时记录临床相关信息，包括发病年龄、性别、肿瘤大小、原发肿瘤部位等，并对所有病例进行随访，记录复发情况。

1.2 免疫组化及结果判读所有样本均经10%中性缓冲福尔马林固定、常规脱水、石蜡包埋、3 μm厚切片，HE染色，显微镜下观察。免疫组化染色采用EnVision两步法。抗原修复方法为Ttrs-EDTA (pH 9.0)高压蒸汽修复。所用一抗为鼠抗人β-catenin单克隆抗体(UMA4B5，北京中杉金桥公司)，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判读参照文献[3]，β-catenin以细胞核着色判为阳性，同时阳性细胞数比例>10%判读为阳性。

1.3 CTNNB1基因突变检测采用FFPE组织DNA提取试剂盒(天根生化北京公司，DP331-02)提取组织样本DNA。选取肿瘤组织>30%，肿瘤细胞含量>200个的蜡块，5 μm厚连续切片10张，放入灭菌EP管中，二甲苯脱蜡后严格按照试剂盒说明书进行操作。使用VeritiTM DX PCR仪扩增CTNNB1基因3号外显子目的片段，引物由生工生物上海公司合成，上游引物序列5′-TCCAATCTACTAATGCTAATACT GTTTCGTA-3′，下游引物5′-GCAAAAAGTTTTCCTGTTATC CA-3′，长度为308 bp。PCR反应体系为2×Reaction Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板2 μL，RNase-free Water 8.3 μL，总体系25 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40个循环；最终72 ℃延伸5 min。PCR产物交由生工生物(上海)公司武汉测序部进行测序，测序结果与基因组DNA序列进行比对，参考序列为NM_001904.3。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对分类资料比较采用χ2检验或精确Fisher概率法；采用局部无复发生存率(local recurrence free survival, LRFS)评估复发状态，其中生存资料起点为手术日期，终点为术后肿瘤第1次复发时间，生存分析描述采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，生存曲线绘制采用Graphpad prism。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征32例侵袭性纤维瘤病中男性6例，女性26例，男女比为1 ∶4.3。年龄4～65岁，平均34岁，中位年龄32岁。肿瘤发生部位：腹壁者12例，皆为女性，其中4例有明确剖宫产史，1例有阑尾炎手术史；腹腔内及肠系膜者5例，其中男性3例，女性2例，1例有多发子宫肌瘤病史；腹壁外者15例，其中男性3例，女性12例。肿瘤最大径1.5～15 cm，平均7.5 cm，中位数7.5 cm。随访截至2020年4月20日，随访时间6～93个月，中位随访时间29个月，平均42个月，其中6例失访，未失访病例中未出现患者死亡，其中复发10例，复发时间在术后6～44个月。

2.2 病理检查眼观：肿瘤切面多为灰白色，实性质韧，与周围界限不清(图1)。镜检：可见梭形细胞条束状增生，由纤维母细胞和肌纤维母细胞组成(图2)，部分细胞排列也可呈波浪状(图3)，病灶周围可见梭形肌纤维母细胞向周围肌肉组织穿插，可见多核肌巨细胞(图4)。免疫表型：32例侵袭性纤维瘤病中β-catenin核阳性病例占84.4%，多伴有胞质阳性(图5)，部分病例未出现核表达(图6)。

2.3 分子检测结果32例CTNNB1突变阳性侵袭性纤维瘤病中，T41A 21例(图7)，S45F 4例(图8)，S45P 4例(图9)，S33P 1例(图10)，S33T合并G34R 1例(图11)，A39_G48del 1例(图12)。不同CTNNB1突变位点与β-catenin蛋白表达无明显相关性(P>0.05，表1)。同时发现5例β-catenin阴性但CTNNB1基因突变阳性病例，其中3例T41A、1例S45P、1例S45F皆存在不同程度胞质阳性，1例出现胞核阳性，但比例<10%。

2.5 预后分析Kaplan-Meier结果显示，不同CTNNB1突变类型之间LRFS差异有统计学意义(P<0.05，图13)，而不同年龄、肿瘤最大径、肿瘤原发部位、β-catenin蛋白表达水平中LRFS差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 侵袭性纤维瘤病中β-catenin蛋白表达与CTNNB1基因突变情况

2.4 CTNNB1基因突变与侵袭性纤维瘤病临床病理特征的关系在侵袭性纤维瘤病中，不同CTNNB1基因突变类型中患者年龄、性别、发病部位、肿瘤大小差异均无统计学意义(P均>0.05，表2)。

表2 CTNNB1基因突变与侵袭性纤维瘤病临床病理特征的关系

临床病理参数nCTNNB1基因突变T41S45其它突变类型P值性别 男63210.477 女261862年龄(岁) ≤352011720.198 >35121011部位 腹壁12651 腹壁外1510320.416 腹腔内及肠系膜5500肿瘤直径(cm) ≤583410.110 >5241842

①②③④⑤⑥

图7 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因T41A突变

图8 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因S45F突变

图9 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因S45P突变

图10 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因S33P突变

图11 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因S33T合并G34R突变

图12 侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因A39_G48del突变

3 讨论

侵袭性纤维瘤病是一种发生于深部软组织，以纤维母细胞和肌纤维母细胞增生为主的疾病，伴有Wnt信号通路异常激活[1]。β-catenin作为经典Wnt信号通路的关键因子之一，已有文献报道侵袭性纤维瘤病中存在β-catenin核高表达，同时该现象有助于侵袭性纤维瘤病的诊断和鉴别诊断[4]。但其它研究[5-6]发现β-catenin也可在其它肿瘤，如孤立性纤维性肿瘤、皮肤隆突性纤维肉瘤、子宫内膜间质肉瘤和滑膜肉瘤中出现一定程度核表达，尤其是需要鉴别诊断的梭形细胞肿瘤(如胃肠道间质瘤，低级别肌纤维母细胞肉瘤等)。因此，β-catenin核表达对于侵袭性纤维瘤病辅助诊断缺乏特异性，仅作为支持性依据。目前针对β-catenin免疫组化判读缺乏公认标准，多数文献以>10%的肿瘤细胞核着色判读为阳性[3,7]，同时采用该标准判读β-catenin的阳性率69.5%～91.7%。本实验发现84.4%的侵袭性纤维瘤病中存在β-catenin核阳性，同时部分病例伴有胞质着色，与文献报道一致。

图13 不同CTNNB1突变位点的LRFS曲线

针对β-catenin免疫组化在侵袭性纤维瘤病辅助诊断中的缺点，Le Guellec等[2]针对254例侵袭性纤维瘤病和175例形态学上易与侵袭性纤维瘤病相混淆的梭形细胞病变，进行CTNNB1基因突变检测，发现88%的侵袭性纤维瘤病中存在CTNNB1基因突变，而其它梭形细胞病变中未发现该基因exon3改变。相较于传统的β-catenin免疫组化检测，CTNNB1基因突变检测具有更好的特异性，结果判读更为准确和客观。侵袭性纤维瘤病中CTNNB1基因突变类型以T41A最常见，其次为S45F、S45P，同时存在少量罕见突变类型，如T41I、G34A、S37A、S33T+G34A、S45C、D32G等[3,7]。本实验选取CTNNB1突变阳性病例，发现其突变类型的分布与文献报道一致，同时伴有S33P、S33T、A39_G48del等少见突变类型。近年有学者研究侵袭性纤维瘤病中β-catenin免疫组化检测与CTNNB1基因突变的关系，发现不同免疫组化评判标准对两者的一致性影响较大，当免疫组化以低强度染色(核阳性>1%或10%)为标准时，两者差异无统计学意义[7-8]。采用本实验判读标准，不同基因突变类型中β-catenin免疫组化表达无明显差异，与文献报道一致。同时本实验发现，部分病例CTNNB1突变阳性，而β-catenin免疫组化阴性，该部分病例都出现不同程度胞质阳性，考虑这部分病例虽然出现CTNNB1基因突变，致使β-catenin蛋白结构异常，与降解复合物解离，在细胞质中异常累积，但未累积到一定水平，导致并未出现明显转位入核的现象。

侵袭性纤维瘤病中不同CTNNB1基因突变分型与临床病理特征的关系尚存在争议。部分文献发现S45作为一种独立的突变类型，更容易发生在患者腹壁外部位，尤其是四肢末端[2,9]。Colombo等[10]认为S45突变类型更容易发生在肿瘤直径较大的病例中。而van Broekhoven等[11]认为S45与肿瘤大小和发病部位无明确相关性。近期Koike等[7]对104例侵袭性纤维瘤病研究发现，不同CTNNB1基因分型与患者年龄、性别、肿瘤大小、发病部位无明显相关性。本组未发现不同CTNNB1基因突变类型与临床病理特征存在相关性，与部分文献报道一致，考虑可能是由于纳入S45突变类型的样本量较低所致。

侵袭性纤维瘤病通常与周围组织界限不清，常浸润至邻近软组织，临床上切除不净极易复发，因此针对侵袭性纤维瘤病肿瘤局部复发的研究具有重要临床价值。有学者认为CTNNB1基因突变型，尤其是S45F突变类型与侵袭性纤维瘤病患者复发密切相关[10-11]，同时仍有部分学者持相反观点[12]。对于罕见突变类型位点如S33、G34等，与侵袭性纤维瘤病复发的关系却少见报道。本组发现不同CTNNB1突变位点之间LRFS存在差异，可能是由于不同位点突变对β-catenin激活程度不一致所致，而β-catenin异常激活聚集又可以促进肿瘤细胞增殖[13]。相关基础研究也发现存在S45F突变类型的侵袭性纤维瘤病细胞系更容易出现β-catenin细胞核聚集现象[14]。Rebouissou等[15]针对肝细胞腺瘤(hepatocellular adenomas, HCA)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的研究发现，在HCA/HCC中exon3缺失突变和D32-S37点突变导致β-catenin高强度激活，T41位点突变导致β-catenin中等强度激活，虽然S45导致β-catenin较弱的激活，但由于其等位基因的复制，导致β-catenin强表达。

综上所述，本实验结果显示侵袭性纤维瘤病中存在β-catenin蛋白异常表达和CTNNB1基因突变等分子病理事件，同时CTNNB1基因突变位点可能是影响局部肿瘤复发的因素。但考虑本组纳入CTNNB1基因突变的样本量较少，计划后续进一步加大样本量进行验证。