EDTA脱钙在骨组织大切片制片中的应用效果

翁丹枫，傅晓丹，陈淑惠，张真真

骨肿瘤病理大切片可以观察组织全貌，准确评估病灶大小、侵袭范围以及手术切缘，对于确定骨肿瘤的边界和临床预后非常重要。但骨组织中丰富的钙盐导致完整制片困难，尤其是大切片的制作。普通酸性脱钙液因破坏细胞及组织结构，影响染色、镜下观察和分子检测，已不适用于日常工作，而EDTA脱钙液性质温和，能有效保护组织内的核酸和组织抗原，日益成为骨标本处理的首选[1-2]。本科室将EDTA脱钙液应用于骨组织大切片制片及染色过程，总结了骨组织大切片的制作方法，以期在临床骨病变标本的处理中推广应用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂锯骨机(昊鹰HYTW-300)，脱水机(Thermo Pathcenter)，多功能染色机(Leica ST5020)，磁力搅拌器(博大HMS-901)，恒温摇床(南荣NRY-100C)，平推式切片机(REM-710，大和公司)，10%中性福尔马林，不锈钢包埋模具(6.5 cm×4.5 cm)、包埋脱水盒(6.5 cm×4.5 cm×1.0 cm)，载玻片(5.5 cm×5.1 cm)(图1)，盖玻片(5.5 cm×4.8 cm)。20%EDTA脱钙液的配制：取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，购自上海泸试化工公司，货号6381-92-6)250 g于烧杯中，倒入磷酸盐缓冲液至总体积1 000 mL；置于磁力搅拌器37 ℃恒温搅拌，加入25 g氢氧化钠继续搅拌至完全溶解；测pH值为7.2～7.6。

1.2 取材与固定选取福建医科大学附属第一医院病理科接收的股骨头坏死和骨肿瘤标本20例，将骨组织标本用锯骨机沿着矢状面最大切面锯开，锯成大小4 cm×6 cm、2～8 mm厚的骨薄片，用10%中性福尔马林室温下固定24～48 h。

1.3 脱钙固定好的骨组织切片完全浸没于20%EDTA脱钙液中，置于37 ℃恒温摇床(HNY-100B，长沙巴跃仪器公司)，以60 r/min匀速缓慢摇动，期间每隔2天换脱钙液，直至尖镊较易刺入骨组织为脱钙完成。

1.4 脱水与包埋将脱钙后的骨组织放入大组织专用脱水机，针对不同厚度的组织选用相应的脱水程序(表1)，2～5 mm厚组织脱水时间为17 h，5～8 mm厚组织脱水时间为27 h。经58～60 ℃硬蜡包埋，包埋时将组织放在包埋框模具中，先向蜡槽加入一半石蜡，将组织放入蜡槽内，尽量居中压平，轻力按压一段时间后，盖上包埋盒并灌加石蜡包埋，即制作成大蜡块。

表1 骨大组织脱水流程中透明和浸蜡的时间

1.5 切片蜡块整修后放入平推式滑动切片机上5～7 μm厚切片，45°角进刀。切片机可装2个刀片，先用废弃旧刀片修去表面余蜡，再换新刀片切出蜡片，要求切片厚度均匀，组织完整。因骨组织比较脆硬，切片时要缓慢、力度均匀，配上加湿器可使组织湿润不易出现脆裂现象。经37 ℃蒸馏水和45 ℃温水2次展片，摊片时应小心、轻柔且动作迅速，然后把蜡片捞于大载玻片上，沥水晾干2 h后70 ℃烤片20～30 min，以防止染色过程中脱片。

1.6 HE染色将玻片斜插于染色架上(图2)，后直接放入Leica ST5020全自动染色机中进行HE染色。

1.7 Masson染色切片脱蜡水洗，入铁苏木精5～10 min，0.5%盐酸分化，流水至蓝化，入酸性品红5～10 min，磷钼酸分化3～5 min，置于甲苯胺蓝1 min，倾去染液，用1%冰醋酸洗，最后脱水、透明、封固。

①②

1.8 免疫组化采用免疫组化EnVision两步法检测CK、EMA和Ki-67在股骨颈大切片转移癌中的表达，抗体及试剂盒均购自福州迈新公司，一抗工作浓度为1 ∶100，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

骨组织7～10天脱钙完成，经EDTA脱钙后的骨组织脱钙充分，软硬适中，完全脱水，切片完整。HE染色显示：股骨头坏死(图3A、B)和硬化型骨肉瘤(图3C)大切片HE着色均匀，组织完整无钙盐残余，无脱落和皱缩。骨肉瘤和股骨头坏死灶内细微结构：包括蓝色幼稚骨组织(图4A)，红色股骨头坏死，蓝色坏死周围胶原(图4B)，肉芽组织背景中微血管增生(图4C)，提示大切片Masson染色有助于幼稚骨样组织的识别、股骨头坏死灶影像及病理的对比观察和各种物质的量化评估。股骨头转移癌大组织切片免疫组化结果显示：EDTA脱钙对癌组织EMA(图5A)、CK(图5B)和Ki-67(图5C)在染色强度和范围无显著影响，提示EDTA脱钙大组织切片有助于保持细胞胞膜、胞质及胞核的抗原。

3 讨论

骨大组织切片可以突破小切片的局限性，能够在同一张切片中观察整个骨病变的细微结构，完整显示骨质破坏的范围和程度，反映骨组织周围软组织的变化，整体性强，有利于骨病变的病理诊断及预后判断。但是前期骨标本脱钙是骨组织大切片制作的难点和关键。EDTA是一种优良的脱钙螯合剂，其脱钙作用优于酸性溶液，对组织破坏极小，能保持组织细胞的完整结构，尤其细胞显微化学改变甚微，且能保存组织中抗原物质的活性，在免疫组化方面具有较大优势[2]。研究表明EDTA脱钙液用于大鼠胫骨组织脱钙时间需3周以上[3]，无法满足临床快速诊断需要。适当提高EDTA脱钙液浓度和温度能够缩短脱钙的时间[4-5]，因此我们采用浓度为20%EDTA脱钙液，并且脱钙过程始终在37 ℃恒温摇床中进行，通过恒温加热及震荡加速脱钙液渗入组织。结果表明，脱钙时间缩短至1周，节省了脱钙时间并提高工作效率，且HE、Masson和免疫组化染色结果显示其对骨大组织细微结构及组织内酶类和抗原保存良好。

本组通过多次实验摸索，总结EDTA脱钙制备骨病变大切片的方法：(1)骨组织大切片的取材厚度2～3 mm为佳，太厚则影响组织的固定、脱钙和脱水效果，太薄组织经脱水和浸蜡后易变形，包埋时组织不平整，切面不完整，较难完整制片；(2)组织固定、脱钙和脱水时间要充足，为确保骨组织充分脱钙和脱水，脱钙液每隔1天要更换，组织脱水处理所用试剂须根据使用情况及时更新，保持有效浓度，脱水完全可以防止掉片；(3)脱钙完成后经流水冲洗15 min，防止残余EDTA在乙醇和组织中沉淀，影响组织染色；(4)浸蜡温度以62～65 ℃为宜，建议用熔点为58～60 ℃的硬蜡，温度太高会使组织细胞变形变脆，核皱缩，切片易皱缩脱落，组织块容易龟裂；而温度太低则影响液态石蜡向组织的浸透，组织浸蜡不充分影响切片；(5)包埋要平整，对组织翘起部分，可使用按压工具，待底层石蜡凝固后，轻轻盖上包埋盒再灌注石蜡，可防止气泡，包埋时的冷冻时间也需要严格控制，冻至蜡块表面发白后转移至常温放置；(6)切片时要匀速进刀，过快或过慢刀口均容易卡住蜡块，且不需要冷冻蜡块，但需要使用加湿器消除静电[6]，切片后室温晾干1 h以上，再放入烤箱70 ℃烤片30 min再行后续染色；(7)行特殊染色和免疫组化染色时需制作上胶片：普通载玻片涂沫粘附剂如多聚赖氨酸或APES稀释后用丙酮浸泡，再过乙醇、蒸馏水，最后烤干待用，可防止掉片。

③A③B③C④A④B④C⑤A⑤B⑤C

综上所述，在37 ℃下20%EDTA脱钙用于制作骨大组织切片的方法简便易行，耗时短，且染色符合形态学观察要求，适用于临床和科研对骨组织大标本的形态学观察、影像学比对、骨肿瘤化疗效果、骨坏死程度和范围的评估，为骨病变的分子检测奠定基础，值得推广使用。