带植入物病理组织标本切磨片制作技术探讨

朱福余，孙立魁，贾晓猛，刘成虎

硬组织病理切磨技术主要是针对骨组织、带植入物的骨组织、埋置有坚硬植入物的其他组织标本，或在动物试验阶段进行了亲骨荧光素标记的不能进行脱钙的骨组织，通过脱水、浸润、包埋处理，由硬组织切磨系统完成的组织病理切片制作的技术。有文献报道骨组织及埋置坚硬植入物的组织进行病理组织切片制作，通常利用EXAKT硬组织切磨系统[1-3]。硬组织病理切磨技术最显著的特点是不破坏组织中的植入物，且保持了组织与植入物之间原有的组织结构形态，这对研究组织内植入物的长入情况具有重要意义。本文结合本实验室日常硬组织制片工作经验，分析硬组织病理切片制作的每个处理环节，以期能为其他技术人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织标本试验样品CF/PEEK复合材料按照国家标准GB/T 16886.6-2015医疗器械生物学评价：植入后局部反应试验的要求进行试验[4]。动物试验周期结束后，获取到埋置有CF/PEEK复合材料的肌肉组织块合计36块。

1.2 主要试剂及仪器设备10%磷酸盐缓冲中性福尔马林(济南百博生物公司)，无水乙醇(国药集团化学公司)，苏木精染液、伊红染液(北京索莱宝公司)，Technovit 7200 VLC树脂试剂盒，EXAKT 300 CP硬组织切片机、400 CS硬组织磨片机、402平行粘片装置、510脱水浸润仪、520光固化包埋机、530干燥渗透聚合装置(德国EXAKT公司)。

1.3 方法

1.3.1组织标本的固定 组织经10%中性福尔马林固定，固定液的量一般为被固定组织标本体积的10倍。固定24 h后，更换新的10%磷酸盐缓冲中性福尔马林进一步固定。

1.3.2组织的切割取材 将充分固定后的组织标本经硬组织切片机切割为5 mm厚标本，置于10%磷酸盐缓冲中性福尔马林中继续固定12 h后再进行后续操作。切割取材前应详细观察组织标本块的外观，详细了解植入物的植入位置、植入方向、植入深度等。切割取材过程中应防止样品与组织脱离。切割取材后的组织标本置于自来水中，流水冲洗至少1 h，水流应尽可能的小，操作过程应轻柔，以防植入物与组织脱离。

1.3.3标本脱水 将组织标本依次置于50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ，分别脱水48 h，不同浓度乙醇要现用现配。在抽真空、震荡的条件下进行脱水会提高脱水效果。

1.3.4标本浸润 脱水结束后，将标本逐级浸入不同体积比的乙醇/Technovit 7200 VLC树脂(70%/30%、50%/50%、30%/70%)混合液中进行浸润，每一步骤处理48 h，后置于100%Technovit 7200 VLC树脂Ⅰ缸处理14天，100%Technovit 7200 VLC树脂Ⅱ缸处理14天。注意浸润过程中要避光，且温度不超过25 ℃，每隔一段时间对样本进行监控、检查，避免其固化。值得注意的是，在抽负压、真空条件下浸润，可以使组织得到充分浸润，且可以有效减少组织块中残存的气泡。

1.3.5光固化包埋聚合 取出浸透完全的标本，将需要观察的组织切面向下置入塑料包埋模具中，加入Technovit 7200VLC光聚树脂，利用EXAKT530干燥渗透聚合装置抽真空，排净组织块内残存的气泡。固化过程由低强度的黄光与高强度的蓝光共同辐照完成，先黄光辐照6 h，后蓝光辐照8 h，经辐照光固化聚合后埋置有CF/PEEK复合材料的肌肉组织树脂包埋块(图1)。

1.3.6平行粘片制作 利用千分尺测量载玻片A的厚度，共计测量3次，取平均值，将聚合过的组织标本包埋块从包埋模具中取出，利用Technovit 4000粘合剂套装将包埋块粘于载玻片A上。将粘附有标本包埋块的载玻片A经真空吸附于EXAKT 300 CP切片机样本头上，通过激光定位装置，在包埋标本上进行定位，经带锯切割暴露出需要的切面，抛光后利用千分尺测量载玻片A、黏合剂、标本包埋块的总厚度，共计测量3次，取平均值。另取一张载玻片B，利用千分尺测量载玻片B的厚度，共计测量3次，取平均值。在EXAKT 402载片黏合装置上用Technovit 7210 VLC精密粘合剂将载玻片B黏附于标本块的抛光面，如此载玻片A、树脂包埋标本块、载玻片B合成一个类似三明治的结构，测量其总厚度，共计测量3次，取平均值，进而计算出胶的厚度，以便后续进行切片。

1.3.7切片 用EXAKT 300 CP硬组织切片机将包埋有组织标本的树脂块进行切割，一般将切割厚度设为200 μm。值得注意的是，在切片过程中任何外力都会使切割面产生凹凸不平现象，因此切片过程中切勿施加外力干扰。切片完成后，取出切片，取下样本块，利用千分尺测量(切片+胶+组织)总厚度，进而计算出实际切割下来的组织标本厚度。

1.3.8磨片 经EXAKT 400 CS硬组织磨片机进行磨片，先进行粗磨，再进行精磨，最后进行抛光，将组织磨至30 μm厚。

1.3.9组织切片的染色 将组织切磨片经蒸馏水充分清洗后，参照文献[5]的方法进行染色：苏木精染液30 min，自来水充分冲洗，1%盐酸乙醇分化30 s，流水冲洗后再入温水返蓝，置伊红染液5 min，自来水冲洗，待组织切片自然干燥后经Technovit 7210 VLC封片，光镜下观察。

2 结果

制得的组织切片经HE染色后，细胞核、细胞质着色对比鲜明，组织细胞形态清晰，可直接在光学显微镜下进行组织学观察，可见植入的CF/PEEK复合材料与周边肌肉组织结合紧密(图2、3)，植入的复合材料周围可见新生纤维结缔组织，纤维囊壁结构已形成。

①②③图1 埋置有CF/PEEK复合材料的肌肉组织标本树脂块图2 低倍镜下埋置有CF/PEEK复合材料的肌肉组织病理切片:a.试验样品CF/PEEK复合材料;b.肌肉组织图3 高倍镜下埋置有CF/PEEK复合材料的肌肉组织病理切片:a.试验样品CF/PEEK复合材料;b.肌肉组织

3 讨论

GB/T16886.6-2015医疗器械生物学评价标准中提到对植入物的评价，要特别关注组织与材料之间的界面，且该标准推荐采用硬组织制片技术进行组织切片制作[4]。对埋置有种植体的组织标本进行制片时，硬组织切磨技术可以直接切含有坚硬植入物的组织标本，而普通的石蜡包埋组织切片需要先剔除组织内埋置的植入物，这往往会使原有的组织结构形态发生改变，无法客观的评价植入物与周边组织的结合情况，影响后期的评价分析。骨组织是由大量钙化的细胞间质和骨组织细胞组成，为结缔组织的一种，因细胞间质内有大量钙盐沉积，故骨组织质地十分坚硬，石蜡包埋组织切片必须对骨组织进行脱钙处理[6-8]。脱钙会使组织细胞皱缩，同时会使骨的矿化结构遭到破坏，而硬组织切磨技术无需脱钙处理，完整的保存了骨组织的矿化结构，组织切片经染色处理后，可用于研究骨修复材料植入后的骨组织形态计量学及骨整合相关的研究。虽然树脂包埋硬组织制片也存在不足，如制片过程复杂，制片操作步骤繁琐，尽管存在难点，但硬组织切磨技术能够保持种植体与周边组织界面的组织结构，可直观反应结合界面的生长结合情况，是目前研究种植体-组织结合界面重要的技术方法。