改良亚甲基蓝碱性品红染色法显示新型冠状病毒肺炎肺组织中病毒包涵体

吴 昊，阎红琳，袁静萍

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)在全球范围内持续蔓延。根据血清型和基因组特点，冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，SARS-CoV-2是一种属于β属的新型冠状病毒[1]。在某些病毒感染的细胞内，用普通光镜可看到大小和数量都不同的圆形或不规则小体，称为病毒包涵体，可用特殊的病毒包涵体染色法明确有无病毒感染。笔者通过查阅资料使用改良亚甲基蓝碱性品红染色法显示COVID-19肺组织中病毒包涵体，并经多次实验发现染色过程中对分化程度的掌握至关重要，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料在未充分认识SARS-CoV-2病毒感染的疫情早期，有2例患者在武汉大学人民医院接受了肺叶切除术，2例患者均在术后第1天显示淋巴细胞降低，其中1例患者有轻微咳嗽。2例患者流感病毒及其他病毒(乙肝梅丙艾)检测均呈阴性，分别于术后第4天和第6天经核酸检测确诊为COVID-19。回顾性分析患者术前CT示磨玻璃影的病毒性肺炎改变，推测2例患者在术前已感染SARS-CoV-2。因此收集2例患者剩余手术标本，全部取材，经10%中性缓冲福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、3 μm厚切片。石蜡组织切片SARS-CoV-2原位杂交检测为阳性，进一步证实患者术前已感染SARS-CoV-2[2]。本实验经武汉大学人民医院伦理委员会批准(WDRY2020-K005)。

1.2 方法采用改良亚甲基蓝碱性品红染色法标记病毒包涵体：(1)选取同一组织蜡块切片3张脱蜡至水；(2)在0.25%碱性品红中染色25 min；(3)水洗；(4)根据柠檬酸分化时间长短分为A、B、C三组。A组切片经0.5%柠檬酸分化4～6 min至切片无红色残留，B组切片经0.5%柠檬酸分化1.5～2.5 min至切片呈浅粉红色，C组切片经0.5%柠檬酸分化20～30 s至切片呈浅红色；(5)水洗；(6)分别用0.5%亚甲基蓝复染10 s；(7)水洗；(8)风干切片；(9)中性树胶封固。

2 结果

A组切片全片皆为蓝色背景，无红色或紫红色阳性信号，不利于观察病毒包涵体(图1)；B组切片可见病毒包涵体位于细胞质里，呈紫红色，嗜酸性，周围有空晕，其他背景为蓝色，红细胞或黏液的非特异性染色较少(图2)；C组切片蓝色背景下见大片红细胞及纤维蛋白渗出物呈红色非特异性染色，偶见细胞中类似于病毒性包涵体的染色，但与周围红细胞染色类似，不能区分是病毒包涵体还是红细胞(图3)。

①②③图1 切片经0.5%柠檬酸分化4～6min 图2 切片经0.5%柠檬酸分化1.5～2.5min(红箭头示病毒包涵体) 图3 切片经0.5%柠檬酸分化20～30s(黑箭头示红细胞,红箭头示类似于红细胞也类似于病毒包涵体)

3 讨论

病毒颗粒较小，直径10～30 nm，在电镜下才能观察，若想从病理技术角度较准确的鉴定它，可在其侵入宿主细胞形成病毒包涵体后，应用多种特殊染色方法显示和确定。常用的病毒包涵体特殊染色方法：Mann亚甲蓝伊红染色法、改良亚甲基蓝碱性品红染色法、Lendrum玫瑰红酒石酸染色法。比较三种特殊染色方法，改良亚甲基蓝碱性品红染色法比其他两种染色方法耗时短(<1 h)，分化过程易掌握，包涵体清晰可见，层次分明，应用较广泛[3]。

传统亚甲基蓝碱性品红染色法主要步骤：在梯度乙醇和蒸馏水中脱蜡和水化；0.25%碱性品红染色30 min；0.5%柠檬酸分化3 s；自来水冲洗2 min；用1%甲基蓝复染15～30 s；自来水冲洗；脱水，透明，封固。但在实际过程中由于标本不同，各实验室条件存在差异，本实验对以上步骤各环节均进行了摸索，探索出一种适合本科室的实验步骤。

首先，用改良亚甲基蓝碱性品红染色法显示COVID-19肺组织中病毒包涵体，严格控制分化程度。分化时间过久，细胞核、细胞质及纤维结缔组织等均呈无色，病毒包涵体的着色也被分化掉，亚甲基蓝复染后全部显示为蓝色，不利于病毒包涵体的显色；分化时间过短，细胞核、细胞质及纤维蛋白渗出物等均呈红色，亚甲基蓝复染后红细胞及纤维蛋白渗出物仍显示红色，造成染色层次不分明，同样不利于病毒包涵体的显色。笔者经反复实验总结，将在光镜下对分化的微观控制转化为宏观的切片在白色衬底下的颜色控制(红→浅红→浅粉→无色)，并考虑了组织大小等因素，从而记录了各种分化程度所需要的时间：切片从红色到浅红色分化时间为20～30 s；切片从浅红到浅粉的分化时间为1.5～2.5 min；切片从浅粉到无色的分化时间为4～6 min，因此本文根据以上经验将柠檬酸分化时间长短分为A、B、C三组：A组分化4～6 min，切片无红色残留；B组分化1.5～2.5 min，切片呈浅粉红色；C组分化20～30 s，切片呈浅红色，并观测到分化1.5～2.5 min的效果更好，既有阳性结果，又减少了红细胞及黏液的非特异性染色。

其次，实验初查阅文献发现该特殊染色方法显示病毒包涵体多用甲基蓝复染，但由于当时武汉市紧张的抗疫大环境，本科室暂时无法购买甲基蓝试剂，决定使用亚甲基蓝复染，经多次实验观察，也可得到较好的对比效果，不影响实验结果。

再次，染色结束后考虑到后续脱水透明步骤可能有脱色作用，因此省去了切片后续的脱水透明步骤。通过此次实验，笔者发现完全依据参考文献的操作步骤，并不能得到较理想的实验结果，应结合本实验室条件(如组织标本的固定脱水等流程、实验室拥有的试剂药品、实验室温度、湿度等)，在已查阅的染色理论指导下，应用控制变量等实验方法，反复摸索出适合本实验室的标准染色流程。本科室总结得出，用改良亚甲基蓝碱性品红染色法显示病毒包涵体的实验步骤：3 μm厚切片脱蜡至水，0.25%碱性品红染色25 min，水洗，切片经0.5%柠檬酸分化1.5～2.5 min，切片呈浅粉红色，水洗，1%亚甲基蓝复染10 s，水洗，风干中性树胶封固。

综上所述，本实验使用改良亚甲基蓝碱性品红染色法可以较好地显示病毒包涵体，有利于病理工作者从病理技术的角度证实COVID-19肺组织中病毒的存在，为临床治疗和诊断提供有力支持。