基于生物信息学分析ADD3在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

石 林，刘薇婉，张帅帅，任翠爱

弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma，DLBCL)是最常见的淋巴瘤类型，约占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，在发展中国家所占比例更高。DLBCL在表观遗传学、治疗反应、预后等方面存在较大的异质性。一线R-CHOP治疗方案使60%患者能够长期生存，但仍有40%的患者存在治疗无效或短暂缓解后复发的现象[1]。因此，积极寻找新的可以提示DLBCL患者预后的独立生物标志物，具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 Oncomine数据库筛选目标基因 Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)搜索设置是①分析类型：Cancer vs Normal Analysis；②癌症类型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③数据类型：mRNA。设定条件：under-expression，选择Diffuse Large B-Cell Lymphoma点击compare进行分析。P<0.05有统计学意义。

1.2 分析ADD3在不同肿瘤的表达情况 搜索设置是①基因输入：ADD3；②THRESHOLD(PVALUE):1E-4；THRESHOLD(FOLD CHANGE)：2；THRESHOLD(GENE RANK)：TOP 10%；③数据类型：mRNA。P<0.05有统计学意义。

1.3 分析ADD3在DLBCL样本中的表达 搜索设置是①基因：ADD3；②癌症类型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③数据类型：mRNA/DNA。P<0.05有统计学意义。

1.4 GEO数据库下载数据集组进行生存分析 Oncomine数据库搜索设置是①分析类型：Cancer vs Normal Analysis；②癌症类型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③临床数据：Survival Status；选择合适的数据集，在PUBMED上下载数据集组，进行生存分析。

1.5 基于GEPIA2在线分析网站验证ADD3基因与DLBCL异质性生物特征分子的相关性 登录GEPIA2网站(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，选择癌症类型DLBCL，对ADD3进行“Correlation Analysis”验证。

1.6 基于TCGA数据库分析验证ADD3在DLBCL不同亚组中表达情况 登陆癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析网站(UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，①Gene Symbol：ADD3；②TCGA dataset：Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma。点击“explore”；③Links for analysis：Expression，对不同亚组进行分析。

2 结果

2.1 分析筛选出目的基因ADD3 筛选结果显示Oncomine数据库共计收录了40个有关DLBCL的数据合集，总计样本数据2 194个。其中符合DLBCL中“Cancer vs Normal Analysis”设置的数据集共7个，总计551个样本数据。筛选得到排名前200的低表达基因，除去已经被研究报道过的基因，得到目的基因ADD3，ADD3在荟萃分析中，位于显著低表达基因的104位，中位秩次492.0，P=0.02。

2.2ADD3在不同肿瘤中的差异表达情况 检索ADD3在不同肿瘤中的差异性表达，结果显示，Oncomine数据库共收录了有关ADD3的研究共692项，样本数量总计82 519个。其中符合条件的数据集共455项，有5项研究显示ADD3在肿瘤样本中显著高表达，26项研究显示ADD3在肿瘤组织中显著低表达，其中有11项研究显示ADD3在淋巴瘤中低表达。这11项研究具体包括DLBCL，霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。

2.3ADD3在DLBCL样本中的表达情况 筛选出8个符合筛选条件的数据集，结果显示其中7个数据集ADD3的mRNA表达量与正常样本相比，均显示出明显的低表达，且所有差异均有统计学意义。ADD3的DNA表达量没有明显改变，提示ADD3 mRNA表达降低，可能是转录水平出现异常，而不是DNA拷贝数减少的影响。其中Basso Lymphoma(Under-expression Gene Rank：24，P-value：9.24E-11，t-Test：-7.839，Fold change：-2.975)，Alizadeh Lymphoma(Under-expression Gene Rank：27，P-value：1.01E-4，t-Test：-5.049，Fold change：-2.716)，Brune Lymphoma(Under-expression Gene，Rank：2 375，P-value：0.004，t-Test：-3.077，Fold change：-1.944)，Rosenwald Lymphoma(Under-expression Gene Rank：331，P-value：0.005，t-Test：-3.500，Fold change：-1.491)，Compagno Lymphoma(Under-expression Gene Rank：537，P-value：2.15E-14，t-Test：-9.739，Fold change：-2.220)，Rosenwald Multi-Cancer(Under-expression Gene Rank：492，P-value：0.002，t-Test：-3.259，Fold change：-2.276)，Storz Lymphoma(Under-expression Gene Rank：1 513，P-value：0.011，t-Test：-2.869，Fold change：-3.009)为分析mRNA表达的数据集，TCGA Lymphoma(Under-expression Gene Rank：3 809，P-value：0.140，t-Test：-1.117，Fold change：-1.025)为分析DNA表达的数据集。

2.4ADD3对DLBCL患者的预后意义 Hummel Lymphoma Dataset(GSE4475数据集)使用Human Genome U133A Array基因表达谱芯片，共检测221例淋巴瘤患者，包括28例非典型伯基特淋巴瘤患者，8例伯基特淋巴瘤患者，1例伯基特白血病患者，18例成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤患者和166例DLBCL患者，该数据集同时包含了患者的治疗经历，基因异位情况，总体生存时间等，其中具有完整生存信息的123例。Lenz Lymphoma Dataset(GSE10846数据集)使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共检测414例初治的DLBCL患者，该数据集还包含了患者的化疗方案，总体生存时间，年龄，性别，疾病分期等数据。Shaknovich Lymphoma Dataset(GES23501数据集)同样使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共检测69例DLBCL患者的基因表达状况，同时记录患者的年龄，性别，疾病分期，总体生存状况等。从GEO数据库下载上述3个数据集原始数据，分析DLBCL患者的生存预后与ADD3表达量之间的关系。两个数据集生存分析结果皆显示，ADD3低表达组预后更差，差异有统计学意义，图1(A)、(B)。Hummel Lymphoma Dataset中共收集了166例DLBCL患者数据，去除缺少生存预后数据的样本，符合条件的样本共有123个，ADD3低表达组的中位生存期为12.8个月，高表达组为55.3个月，HR=0.531 3(0.323 1～0.873 6)，P=0.012 7，差异有统计学意义。Lenz Lymphoma Dataset(n=414)，ADD3低表达组中位生存期为4.13年，高表达组未达，HR=0.5642(0.415 0～0.767 0)，P=0.000 3，差异有统计学意义。图1(C)为Shaknovich Lymphoma Dataset(n=69)数据集的分析结果，P=0.141 1，差异无统计学意义，可能与样本数量较少有关。由于ShaknovichLymphoma Dataset与Lenz Lymphoma Dataset数据集均使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，整合两个数据集进行生存分析，结果显示，ADD3低表达组中位生存期为6.08年，高表达组未达，HR=0.579 3(0.431 1～0.778 5)，P=0.000 4，差异有统计学意义，图1(D)。由于Lenz Lymphoma的患者分别使用了CHOP化疗方案(n=181)和Rituximad-CHOP化疗方案(n=233)，为了区分不同治疗方案所导致的生存差异，因此，将Lenz Lymphoma分为CHOP-treated和Rituximad-CHOP-treated两个亚组，分别进行生存分析和表达量分析，结果显示，在不同亚组间，ADD3的表达量无明显差异，且ADD3低表达组预后皆为不良，图1(E)、(F)、(G)。

图1 ADD3表达水平与患者预后关系

2.5ADD3低表达为DLBCL的预后不良因素，与年龄、性别等因素无关 对Hummel Lymphoma Dataset，Lenz Lymphoma Dataset进行亚组分析(由于Shaknovich Lymphoma Dataset样本量较少，故不再进行亚组分析)，图2(A)、(B)，Hummel Lymphoma Dataset数据集显示，DLBCL中ADD3的表达量在性别和年龄亚组无显著差异。图2(C)显示，Lenz Lymphoma Dataset中，在性别亚组，ADD3的表达量无明显差异。图2(D)显示，Lenz Lymphoma Dataset中，在年龄亚组，21～40岁年龄组，ADD3的表达量要高于41～60岁(P=0.006)、61～80岁(P=0.013)、81～100岁(P=0.002)年龄组。由于81～100岁年龄组人数较少，且41～60岁、61～80岁、81～100岁年龄组中ADD3的表达量无明显差异，因此，将样本分为21～40岁年龄组和41～100岁年龄组两个亚组进行分析，结果显示在21～40岁亚组中，ADD3低表达组预后更差，HR=0.101 8(0.022 83～0.454 2)，P=0.002 7，差异有统计学意义，图2(E)。41～100岁年龄组中，ADD3低表达组中位OS为3.93年，ADD3高表达组的中位OS为7.49年，HR=0.618 5(0.451 4～0.847 4)，P=0.003 1，差异有统计学意义，图2(F)。在不同年龄亚组中，ADD3低表达组预后皆为不良。

图2 DLBCL的预后不良因素

2.6ADD3与DLBCL异质性生物特征分子呈弱相关性 比较显示ADD3与DLBCL异质性生物特征分子c-Myc(P=0.014，R=0.36)，Bcl2(P=0.000 55，R=0.49)，P53(P=0.003 1，R=0.42)等呈弱相关性。

2.7 UALCAN网站验证ADD3在DLBCL不同亚组的表达 数据库分析网站(UALCAN)，对DLBCL中疾病阶段，种族，性别，体质量，年龄以及TP53突变等亚组进行逐个分析，结果显示DLBCL中ADD3的表达与疾病阶段，种族，性别，体质量，年龄以及TP53突变等无关，图3。

图3 ADD3在DLBCL不同亚组的表达

3 讨论

DLBCL是具有高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，根据Globalcancerstatistics 2018的最新统计[2]，非霍奇金淋巴瘤的发病率占全球癌症发病率的2.8%，死亡率占全球癌症致死率的2.6%，虽然一线R-CHOP化疗方案使得DLBCL患者的生存率大大提高，但由于临床与病理诊断的异质性与复杂性，仍有部分DLBCL患者，存在难治与缓解后复发等现象[3]，目前Bcl2，c-Myc，P53突变等遗传学异常已被证实与DLBCL的预后相关[4-5]，因此，寻找新的预后生物标志物，对于治疗DLBCL具有重要的临床意义。

Ocomine数据库是目前全球最大的癌症基因芯片数据库，该数据库收纳整合了全球权威研究团队发表在专业杂志上的公开数据，主要包括肿瘤相关RNA和DNA等数据，是用于挖掘癌症基因信息的权威数据平台。癌症基因图谱(TCGA)是由美国癌症基因研究所和美国人类基因组研究所合作启动的项目计划，收录了人类不同癌症的临床数据，基因组变异数据，mRNA表达数据，miRNA表达数据，甲基化数据等，是癌症研究的重要数据来源。目前基于数据库分析，已成功挖掘出肺腺癌的靶基因KRAS[6]，多发性骨髓瘤的生物靶点CD200[7]，胰腺癌的生物靶点MALAT1[8]等，且均已得到验证。

ADD3(Adducin 3)属于Adducins家族，又名adducin γ，位于染色体10q24.2～24.3，是膜蛋白与肌动蛋白连接处的骨架蛋白，参与血红蛋白中血影蛋白-肌动蛋白网络的构建，细胞信号传导，离子转运，细胞运动与细胞增殖等生命活动[9]。目前关于ADD3的研究较少，Karrie[10]研究发现下调的ADD3在多形胶质母细胞瘤中具有致癌作用，并且ADD3丧失功能的多形胶质母细胞瘤细胞能够通过VEGF/VEGFR2信号传导刺激内皮细胞激活，促进体内肿瘤生长和血管生成。在相关研究中发现，ADD3的耗竭，加速了非小细胞肺癌细胞的迁移[11]。在胆道闭锁的研究中显示，ADD3基因沉默的小鼠与野生型小鼠相比，脏器纤维化程度更高，并通过与NK细胞作用，导致胆道闭锁的发生[12]。Fan的研究显示[13]，通过敲降ADD3的表达，会损害肾传入小动脉和大脑中动脉的肌源性反应，并影响BK通道活性。高度的侵袭性是DLBCL的主要生物学特征，常常侵犯淋巴结组织及周围器官，使其复发率高，预后效果差，ADD3的耗竭可能是通过减少细胞-细胞之间或细胞-基质之间的接触，解除细胞抑制，促进DLBCL细胞迁移，同时激活血管生长，促进了DLBCL的浸润转移。

综上所述，ADD3在DLBCL中低表达，且与预后呈现显著正相关性，ADD3的功能丧失可能会解除细胞之间的接触抑制，促进肿瘤的发生，有望作为DLBCL的独立预后标志物，为治疗和预防DLBCL提供参考靶点。