基于网络药理学及GEO数据分析探究赤芍治疗IgAN的作用机制研究

庞欣欣，邢玉凤，彭紫凝，石秀杰，张雅歌，韩佳瑞

IgA肾病(IgA Nephropathy，IgAN)是全球最常见的免疫相关性肾小球炎症疾病，约占原发性肾小球疾病的20%～47%，主要以半乳糖缺陷型IgA与抗体复合物沉积于肾小球系膜区为病理特征[1]。大多数IgAN患者呈慢性进展性发展，约有15%～40%的IgAN患者在确诊后20年内发展为终末期肾病[2]。临床中IgAN多以血尿、蛋白尿、高血压及肾功能损害为主要表现，但由于其发病机制尚不明确，传统的激素、免疫抑制剂、ACEI类等西药药物治疗不能完全阻止IgAN病情的进展，部分患者不可避免的进入终末期肾病，甚至需要透析治疗[3-4]。

传统医学认为IgAN病机多与血瘀、热邪有关，多将其归于尿血、癃闭等范畴[5]。赤芍为毛茛科芍药或川赤芍的干燥根，味苦、微寒，归肝经，具有清热凉血、散瘀镇痛之功效[6]。其化学成分复杂，主要包括单萜苷类化合物、鞣花酸、谷甾醇、儿茶素等成分[7]。现代药理实验证明，赤芍具有免疫调节、抗氧化、抗炎、降血脂、降血压、抗动脉硬化、抗肿瘤、保肝等作用[8]。以赤芍为组方的方药对IgAN有良好的治疗效果[9]。目前,关于赤芍的研究多集中在化学成分、药理作用等方面，缺乏对其在特定疾病中药物作用机制的探讨。

网络药理学是近年来的新兴技术，在中药抗病机制研究方面具有优势，能够通过建立“药物-靶点-基因-疾病”相互作用关系网络，从多靶点角度对药物成分作用于疾病的机制进行综合分析。基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库，收录了生物学领域大量的高通量实验数据，能够对与疾病发展密切联系的基因进行分析，与网络药理学结合更加符合中医药学整体性和系统性的基本特点[10]。本研究以网络药理学方法为指导系统分析了中药赤芍可能治疗IgAN的活性成分和作用机制，同时采用GEO数据库来验证关键靶点，证实本研究的可行性，为赤芍治疗IgAN活性成分的开发和作用机制研究提供参考。

1 方法

1.1 赤芍有效成分和靶点筛选 通过中药系统药理学数据库分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)挖掘赤芍的所有化学成分，根据各个成分的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)及排泄(Excretion)，即ADME参数筛选有效成分，其中筛选条件为药物口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug like，DL)≥0.18。同时以“Chishao”为关键词在该数据库对赤芍有效成分进行靶点筛选，采用Cytoscape 3.7.2软件对数据进行分析。

1.2 IgAN的相关靶点检索 GeneCards是公共集成数据库，提供了约150个网络来源的以人类基因为中心的全面基因注释和预测信息，包括基因组学、转录组学、遗传信息学、临床基因信息等。以“IgA nephropathy”为关键词在GeneCards里筛选与IgAN有关的所有靶点，并在DrugBank、DisGeNET、GAD等数据库中筛选补充。

1.3 赤芍-IgAN作用靶点筛选及PPI网络构建 将获得的赤芍有效成分靶点和IgAN靶点基因进行Venn分析，获得两者交集靶点基因。药物调控机体的病理生理过程网络关系复杂，除直接作用靶点外，有多重间接调控方式，蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)网络可以辅助探索蛋白质之间的潜在相互作用，发现新的药物靶点，为数据的构建与挖掘提供新方式。STRING数据库可以预测蛋白质之间的相互关系并构建PPI网络，利用该数据库构建赤芍作用靶点与IgAN靶点的交集PPI网络并筛选核心靶点。筛选参数设置主要有生物机体选择为人类，最低要求交互分数设置最高置信度0.4。

1.4 赤芍治疗IgAN网络调控可视化 基于赤芍和IgAN的蛋白互作靶点数据，引入赤芍可作用于IgAN的有效成分，提取两者交集，采用Cytoscape 3.7.2软件把这些数据制作成可视化网络图，其中“圆形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“边”表示不同成分与靶点之间的关系，挖掘其相互之间的作用关系。即得到赤芍治疗IgAN的疾病-药物-分子-靶点调控网络图。

1.5 GEO芯片差异基因验证 利用GEO数据库，搜索“IgA Nephropathy”，物种选择人类，选择基因数据，下载基因矩阵与平台数据文件，运用Perl脚本将下载的探针对应为基因ID。采用R语言中“Limma”安装包，筛选在IgAN组和正常组模型中高表达或低表达的差异基因，获取高表达和低表达的差异基因，其中限定条件P<0.05。

1.6 GO和KEGG富集分析 DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)数据库广泛应用于基因注释，可通过该数据库挖掘基因与疾病的相关性。GO分析是生物学领域中用于基因产物细胞功能、分子功能和生物功能的分类系统，可以通过DAVID工具进行GO富集分析。同时应用DAVID工具对赤芍和IgAN交集蛋白靶标基因进行KEGG通路富集分析，得到赤芍治疗IgAN的主要作用通路。GO和KEGG富集分析，考察赤芍的潜在靶标可能具有的生物学功能，参与的生物学通路。校正统计学超几何分布定量(P.adjust值)来评估存在于各GO和KEGG注释中的蛋白生物学功能和通路富集情况的显著性，P.adjust值在图中颜色越红，显著性越强。

2 结果

2.1 赤芍有效成分及靶点筛选结果 检索TCMSP数据库中赤芍所有成分，按照OB≥30%和DL≥0.18筛选出赤芍有效成分29个。再对赤芍有效成分进行所有靶点筛选，删除未有靶点富集的成分，得到13个有效成分和80个相关靶点，并对数据进行分析，表1、图1。

表1 赤芍有效活性成分

图1 赤芍活性成分及有效靶点六边形代表赤芍，三角形代表赤芍13个成分，圆形代表赤芍的所有靶点

2.2 IgAN的相关靶点检索结果 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等数据库中筛选IgAN相关靶点，删除重复值，共得到1 267个与疾病相关的靶点。

2.3 赤芍-IgAN作用靶点及靶蛋白互作关系分析 将80个赤芍有效成分靶点和1 267个IgAN靶点基因进行Venn分析，得到35个共同靶基因，图2。采用STRING数据库进行PPI分析，得到271条PPI关系，图3。依据其富集节点数目，对靶点做出柱状图，得到赤芍-IgAN核心靶点。其中横轴为富集节点数目，纵轴为靶点基因名称，核心靶点图，图4，主要有蛋白激酶-1(AKT1)、炎症因子-6(IL-6)、c-JUN氨基末端激酶(JUN)、环氧合酶-2(PTGS2)、血管内皮生长因子-A(VEGFA)、半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶家族胱天蛋白酶(CASP3)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、过氧化氢酶(CAT)、趋势因子白细胞介素-8(CXCL8)、磷酸化c-FOS抗体(FOS)等。

图2 赤芍活性成分有效靶基因与IgAN相关靶基因

图3 赤芍与IgAN的PPI关系图黄色：蛋白互作关系；黑色：基因共表达的关系；浅蓝色：蛋白同源性；深蓝色：基因共进化；红色：基因融合；绿色：基因临接

图4 赤芍治疗IgAN的核心作用靶点

2.4 赤芍治疗IgAN网络可视化分析 通过进行赤芍治疗IgAN的疾病-药物-分子-靶点互相作用网络的可视化分析，纳入上述PPI网络筛选的35个基因和分析筛选得到11个赤芍可用有效成分，同时在网络中加入疾病和药物使网络图更加直观，图5。

图5 赤芍-IgAN-有效成分-靶点网络关系图六边形代表赤芍，菱形代表IgAN，三角形代表赤芍11个有效作用成分，圆形代表赤芍作用于IgAN的35个靶点

2.5 GEO芯片差异基因验证 获取GEO数据库下载的GSE93798芯片与平台数据。共计样本42个，其中正常样本22个，IgAN样本20个。分析得到具有显著性差异基因347个，基因高表达为红色，基因低表达为绿色，得到热图图6。通过分析差异基因，验证赤芍治疗IgAN的前10个关键靶点，其中将具有显著性差异的靶点FOS、JUN做出箱式图，图7，P表示差异性。

图6 GSE93798芯片分析热图

图7 关键靶基因FOS和JUN差异分析图*P<0.01

2.6 GO功能富集分析 通过DAVID数据库对赤芍和IgAN交集蛋白靶基因进行GO富集分析，得到赤芍可治疗IgAN的作用靶点的生物学功能50种，综合分析后取前20种功能特性，表2。

表2 赤芍治疗IgAN作用靶点GO功能富集分析(前20位)

赤芍有效成分靶点主要通过肽链内切酶活性、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II型特异性、血红素结合性、四吡咯结合性、泛素蛋白连接酶结合性等生物学功能特性治疗IgAN，图8。气泡颜色越红，则P.adjust值越高，显著性越强，气泡越大，则该生物学功能富集的靶点越多。

图8 赤芍治疗IgAN的相关生物学功能“count”值代表与该生物学功能相关的靶点数量，P.adjust值表示显著性

2.7 KEGG信号通路富集分析 采用DAVID数据库进行KEGG信号通路分析，得到赤芍治疗IgAN的信号通路有120条，综合分析后取前20条信号通路，表3。

表3 赤芍治疗IgAN有效靶点KEGG信号通路富集分析(前20位)

KEGG分析显示，赤芍治疗IgAN的有效靶点主要通过乙型肝炎(Hepatitis B)通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等多条信号通路产生作用，图9。其中柱形图颜色越红，则P.adjust值越高，显著性越强，柱形越长，则该通路富集的靶点越多。

图9 赤芍治疗IgAN关键信号通路横轴代表在该信号通路上的靶点数量，P.adjust值表示显著性

3 讨论

IgAN发病机制复杂，单纯的西医治疗不能有效阻止疾病进展。近年来，中医药在防治IgAN发生发展、延缓肾功能恶化等方面取得了较大进展，临床实践发现，活血化瘀药可以减轻IgAN患者的血尿等症状[11]。反复发作性血尿是其主要特征之一，医家们认为“出血证多伴有瘀血”等观点，正如唐容川所云[12]：“离经之血,与好血不相合，是谓瘀血”，同时王丽萍等[13]发现血瘀证与IgAN肾组织病理损害有一定正相关性，能够反映IgAN的肾脏病变轻重程度，提示瘀血是贯穿IgAN始终的重要因素。另外，热邪侵袭也可导致IgAN患者血尿的生成，如《金匮要略》“热在下焦者,则尿血”，热邪入血，血热互结，血受热煎，不畅而瘀，正如《医林改错》曰：“血受热则煎熬成块”。陈香美等[14]对IgAN中医证候的调查发现，热邪和血瘀证是IgAN最为常见的标证,分别占31.6%和28.9%，这也进一步说明，除血瘀证外，热邪也是IAgN的重要病机。

赤芍性寒、归肝经，为我国传统的清热活血类中药,有着悠久的用药历史,《医学衷中参西录》记载“化瘀血，赤者较优……为其能化毒热之瘀血不使溃脓也”[15]，临床常用于治疗瘀滞疼痛、痈肿疮毒、出血等。血尿是临床上IgAN患者最常见的症状之一，可由血瘀所致[16]。李康康等[17]发现，以赤芍为君药的活血通络方能够改善IgAN患者肌肤甲错、腰痛固定、舌紫黯等血瘀症状，并可以有效降低患者尿红细胞数目、血肌酐、尿素氮等。同时有研究者发现[18]，在大量临床IgAN治疗医案中，以赤芍为组方的枸芪复肾丸也能够改善IgAN患者血尿情况。这些研究提示，赤芍对于改善IgAN患者症状具有良好效果。

本研究利用网络药理学方法筛选出赤芍中有13个主要活性成分及80个靶点，在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等数据库中得到IgAN靶点基因1 267个，与赤芍的靶点映射得到赤芍治疗IgAN的靶基因35个。可知赤芍治疗IgAN具有多成分、多靶点的特点。综合分析“药物-疾病靶点”网络和PPI网络，发现赤芍治疗IgAN的关键化合物有芍药苷、儿茶素、鞣花酸、黄芩甙元、β-谷甾醇、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、(2 r,3 r)4-methoxyl-distylin、7-豆甾烯-3β-醇、菜油甾-5烯-3β-醇等，关键靶点涉及AKT1、IL6、JUN、PTGS2、VEGFA、CASP3、MMP9、CAT、CXCL8、FOS等。通过对GEO数据库临床样本GSE93798芯片的基因矩阵与平台数据文件进行分析，筛选差异基因，验证了在赤芍治疗IgAN的前10关键靶点中FOS和JUN具有显著性差异，进一步证实了本研究的结论。

赤芍总苷是赤芍的主要活性成分，其中又以芍药苷为主。赤芍总苷具有免疫调节、抗炎作用[8]。有研究发现[19]，赤芍总苷能够阻断体内免疫调节Toll样受体的活化、抑制巨噬细胞浸润，降低肾病大鼠24 h尿蛋白排泄率，改善肾功能，延缓肾脏疾病进展。赤芍的另一活性成分儿茶素也具有降低蛋白尿、改善肾功能的作用。有研究发现，儿茶素可通过抑制氧化应激反应、调节肾小球系膜细胞周期调控蛋白表达,抑制肾脏系膜细胞增殖,改善肾小球基底膜通透性,降低蛋白滤过,改善血脂代谢及肾脏功能,延缓肾脏病理慢性进展[20]。本研究通过网络药理学方法发现赤芍可能主要利用以上化合物对IgAN发挥治疗作用。

为进一步分析赤芍治疗IgAN靶点所涉及的信号通路和生物过程，本研究对赤芍治疗IgAN的靶点进行了KEGG信号通路和GO功能富集分析。KEGG信号通路富集分析得到与赤芍治疗IgAN相关的信号通路有120条，其中主要涉及Hepatitis B通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。这些通路大多数与免疫调节、炎症有关，符合IgAN的病理诊断特点。其中Hepatitis B通路主要指HBV感染。HBV感染具有广嗜性，除肝脏外，还能在其他多种脏器中复制，损害相应脏器，而肾脏是最常受累的肝外组织之一。大多数学者认为IgAN是由免疫复合物IgA沉积导致的免疫损伤造成的,且认为HBV所形成的HBsAg抗原抗体免疫复合物在肾小球内沉积导致的免疫损伤是引发乙肝相关性肾炎的主要原因[21]。熊子波等[22]研究发现，伴有HBV感染的IgAN患者，其HBsAg主要在肾小球系膜区沉积。同时有学者研究显示，HBV感染率与IgAN发病率呈正相关[23]。这在一定程度上说明了HBV感染与IgAN密切相关。相关文献表明[24]赤芍能够通过降低HBsAg表达，抑制HBV复制，提示赤芍可能是通过影响HBV通路，改善机体免疫能力来治疗IgAN。

IL-17是一种强大的前炎性细胞因子，也是炎性反应的微调因子，参与肾脏炎性反应的发生和发展[25]。研究发现IgAN患者尿液中IL-17水平明显增加[26]，而患者血清IL-17水平与24 h尿蛋白呈正相关[27]，这些结果提示IL-17可能参与IgAN的发病。林佳如等[28]发现，IL-17可促进半乳糖缺陷型IgA的分泌及免疫复合物IgA的肾脏沉积，引起IgAN的发生，进一步提示IL-17参与了IgAN免疫发病机制及进展。在TNF信号通路中，TNF超家族成员13(TNFSF13)、TNF-α发挥了重要作用。其中TNFSF13已被确定为IgAN的易感基因，且血浆中高水平的TNFSF13与IgAN的预后较差有关[29]。而TNF-α作为一种由免疫细胞分泌的多效应细胞因子，具有抗肿瘤、抗炎和调节免疫功能。Lai等[30]发现，当发生IgAN时肾小球系膜细胞分泌的TNF-α上升，上调足细胞中TNF-α及TNF-αR2表达，进而加重炎症反应。同时TNF-α也可导致足细胞相关蛋白下调，肾小球滤过膜通透性增加，进而造成蛋白尿[31]。在多种慢性肾脏疾病中，赤芍具有调节肾脏TNF-α等炎症因子表达、减轻蛋白尿的功能[32]。这些研究进一步提示本研究预测通路的可行性。除此之外，本研究结果还显示，富集群还包括沙门氏菌感染、人巨细胞病毒感染、HIV等疾病，同时直肠癌、小细胞肺癌等癌症相关信号通路也被显著富集。GO功能富集分析发现，赤芍主要通过肽链内切酶活性、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II型特异性、血红素结合性、四吡咯结合性、泛素蛋白连接酶结合性等生物学功能特性治疗IgAN，这些生物过程均与IgAN的发生有关，也体现了赤芍多成分、多靶点、多通路治疗IgAN的特点。

综上所述，本研究通过网络药理学的科学手段，对赤芍治疗IgAN的机制进行了初步探讨，发现赤芍在治疗IgAN方面的多成分、多靶点、多通路的特点，同时采用GEO数据库对关键靶点进行分析验证，证实本研究可行性，为深入探讨其作用机制提供了科学依据。但是，本研究不可避免的存在一些不足之处，缺乏体内外实验探索，本课题组将对此进行进一步机制研究，为临床治疗IgAN提供新思路。