碳酸二甲酯腹腔注射染毒小鼠急性毒性实验研究

蔡功玉 乔千里 叶荣军 付志华 康 凡王学文 雷乾坤 贺海波 邹 坤 张继红

(1.中国石油化工股份有限公司湖北化肥分公司,湖北宜昌 443200;2.三峡大学生物与制药学院&天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443002;3.三峡大学中医临床医学院,湖北宜昌 443002)

乙二醇(Ethylene glycol,EG)是一种重要的有机化工原料,广泛应用于聚酯纤维、塑料、防冻液、精细化学品、纳米粒子制备等领域[1].EG的生产受到各国的普遍重视,新的合成EG技术路线不断涌现,有力地推动了EG产业的迅猛发展[2],但是合成EG过程中会产生大量的碳酸二甲酯、草酸单乙酯、氮氧化物等副产物,且它们多以蒸汽形式存在于工作场所的空气中.自EG工业化生产以来,我国就不断有职业性中毒事故的报道[3].碳酸二甲酯作为EG合成过程中的重要副产物,在我国的《工作场所有害因素职业接触限值·第1部分:化学有害因素》(GBZ2.1-2007)中已列出了相关EG相关产品(如:EG、乙二醇二硝酸酯、一氧化氮、草酸、甲醇)的空气中容许浓度和职业接触限值,但是碳酸二甲酯并未列出,而它恰恰是合成气制EG过程中重要的副产物和职业性化学有害因素.因此,迫切需要了解碳酸二甲酯对接触者可能造成的伤害.当前国内外尚未制定碳酸二甲酯的职业接触限值标准,对其毒理学的基础研究鲜见涉足.本文对碳酸二甲酯腹腔注射染毒的急性毒性进行了初步研究,为深入开展其毒性机制的研究和开展EG生产过程中的职业防护提供参考.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

电子秤(上海力衡公司);电子天平(梅特勒-托利多公司);多导生理记录仪(美国Biopac公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);多功能酶标仪(瑞士Tecan公司);全自动生化分析仪(美国西门子公司);血细胞分析仪(美国雅培公司);显微镜(日本Nikcon公司);超薄切片机(奥地利莱卡公司);脱水机、显微图像分析系统(德国Leica公司).血常规试剂(拜耳公司);肌钙蛋白I(c TnI,南京建成);生化试剂(北京利德曼);其他试剂为国产分析纯.碳酸二甲酯(中石化湖北化肥分公司提供,批号:20191027).在超净台内配制成实验所需要的碳酸二甲酯溶液,备用.

1.2 实验动物

体质量为18～22 g的SPF级昆明小鼠,雌雄各半,由三峡大学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2017-0012,试验编号:20191005;饲养环境温度为20～22℃,相对湿度40%～70%,12 h/12 h昼夜明暗交替,用灭菌的鼠全价颗粒饲料喂养,待适应环境5 d后,进行毒性实验.实验方案由三峡大学实验动物保护与使用委员会批准,批准号:CTGUEAC-2019-058,并在其指导下进行实验.

1.3 实验方法

1.3.1 急性毒性试验

1)预实验

本实验目的是找出碳酸二甲酯小鼠腹腔注射染毒全部死亡的最小剂量(Dm)及最大全不死剂量(Dn),探索其剂量范围,以便安排正式实验.实验时取小鼠20只,随机分成4组,组间剂量比值为1∶0.85,腹腔注射染毒,给药容量为10 m L/kg.待找出Dm和Dn后,进行半数致死量(LD50)测定;若无法测定LD50值,则按照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》要求,测定最大给药量值.

2)正式实验

根据预实验结果,碳酸二甲酯可测出小鼠腹腔注射染毒Dn=3 707.40 mg/kg,Dm=8 200.00 mg/kg,按照改良寇氏法计算组间r=0.82.120只昆明小鼠(雌雄各半),按体重随机分为正常组和3 707.40、4 521.22、5 513.68、6 724.00、8 200.00 mg/kg共6个剂量组.正常组注射同体积生理盐水.给药2 h后恢复给食,观察7 d.实验结束后,计算LD50及置信区间.

①一般状况观察.实验小鼠在腹腔注射染毒1 h内,连续观察;1～2 h,每10 min观察1次;2～4 h,每30 min观察1次;4～8 h,每1 h观察1次;8～24 h,每4 h观察1次;24 h之后,每12 h观察1次,密切观察各实验小鼠7 d内一般状况、毒性反应和死亡情况.若有濒临死亡小鼠,即刻检测心电图,然后摘眼球取血,再将其解剖,肉眼观察脑、心、肝、脾、肺、胃、小肠、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢等脏器的改变,称其质量,最后固定、包埋和切片染色,在光学显微镜下观察其组织形态学变化.

②心电图检测.小鼠腹腔注射染毒碳酸二甲酯1h后,用乙醚吸入麻醉、固定于鼠板上,用多导生理记录仪记录小鼠心电图(ECG).

③血液学指标检测.7 d后,摘除眼球取血后用血细胞分析仪检测各组小鼠的红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、中性粒细胞比率(NEU)、噬酸性粒细胞比率(EOS)、噬碱性粒细胞比率(BASO)、淋巴细胞比率(LYM)和单核细胞比率(MONO).

④血液c TnI和生化指标检测.摘除眼球取血后,分离血清,分别利用多功能酶标仪和全自动生化分析仪测定血清中c TnI、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性和血糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)含量.

⑤脏器观察和形态学分析.实验小鼠摘眼球取血后,颈椎脱臼处死小鼠,取脑、肺、心、脾、肝、胃、小肠、肾、肾上腺、卵巢、子宫、睾丸、附睾等,观察有无病变;然后将脑、心、肝、脾、肺、肾、卵巢/睾丸等主要脏器称量质量、计算脏器指数[脏器指数(mg/g)=脏器质量/体质量],随即用4%多聚甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片,并经HE染色后,在光学显微镜下观察其病理学变化.

1.3.2 数据统计分析

实验数据用均数±标准差(x±s)表示,其分析在SPSS 23.0统计软件包上进行,组间比较用单因素方差分析,若方差齐,采用SNK检验(Student-Newman Keuls法);若方差不齐时,采用Dunnett-t检验;P＜0.05认为有统计学差异.

2 结 果

2.1 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后小鼠一般情况

实验结果显示,小鼠腹腔注射碳酸二甲酯后,在10～120 min内小鼠出现抽搐、腹式呼吸、四肢发绀、眼球突出等系列中毒反应症状.碳酸二甲酯6 724.00 mg/kg、8 200.00 mg/kg组小鼠出现痉挛、抽搐,自由活动明显减少;3707.40 mg/kg、4521.22 mg/kg组小鼠痉挛、抽搐较轻;8 200.00 mg/kg组小鼠大部分于24 h内精神萎靡、眼球分泌物增加、厌食、最后死亡.72 h后恢复正常,观察7 d无其他异常现象发生.用Bliss法计算得LD50:3 968.50 mg/kg,95%置信区间为2 950.87～5 336.07 mg/kg.小鼠体质量和进食量在腹腔注射染毒后的前4 d明显降低,与同时间点正常组比较具有显著性差异;染毒后第5～7 d腹腔注射染毒组体质量和进食量开始缓慢升高,与同时间点空白组比较具有显著性差异.

2.2 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠ECG的影响

碳酸二甲酯在腹腔注射染毒1 h后小鼠ECG的P-R间期和QRS波延长,J点上移,心率加快,与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).实验结果表明碳酸二甲酯腹腔注射染毒可出现明显的ECG异常(见表1).

表1 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠ECG的影响(±s)

表1 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠ECG的影响(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.05,**P＜0.01(下同).

组别 n HR(heat/min) R-R/ms QRS/ms J/m V正常组 20 466.75±3.32 123.35±2.46 23.05±1.23 0.029 8±0.001 5 3 707.40组 20 474.32±3.85** 131.64±2.28** 25.20±1.54** 0.031 7±0.0024**4 521.22组 20 483.36±3.63** 142.19±2.05** 28.05±2.31** 0.069 1±0.004 3**5 513.68组 20 543.90±4.17** 149.70±2.74** 31.82±2.13** 0.108 6±0.004 7**6 724.00组 20 571.82±4.65** 156.30±2.92** 35.50±2.24** 0.157 4±0.0031**8 200.00组 20 600.27±4.16** 178.41±3.69** 40.85±2.89** 0.200 1±0.003 6**

2.3 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠血液CKMB、LDH活性和cTn I含量的影响

碳酸二甲酯染毒组小鼠血液中CK-MB、LDH活性和c TnI含量明显升高,与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)(见表2).

表2 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠血液中CK-MB、LDH活性和cTnI含量的影响(x±s)

2.4 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠血液学指标的影响

碳酸二甲酯染毒组小鼠血液中RBC、PLT、NEU数目和 HGB含量降低,WBC、LYM、EOS、BASO、MONO数目升高,与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)(见表3).

表3 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠血液学指标的影响(x±s)

2.5 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠血液生物化学指标的影响

碳酸二甲酯染毒组小鼠血液中AST、ALT、ALP活性和TBIL、TP、BUN、CREA含量升高,与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);而CHOL、GLU含量无明显改变(P＞0.05)(见表4).

2.6 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠脏器系数的影响

碳酸二甲酯染毒组小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢脏器系数均出现了升高,其中心、肝、肾、卵巢、睾丸、附睾的脏器系数升高更为明显,与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)(见表5).

表5 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠脏器系数的影响(x±s,卵巢和睾丸、附睾n减半)

2.7 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠心脏组织形态学的影响

正常组小鼠心肌细胞形态正常,肌纤维排列整齐、结构清楚,胞核中央位、且清晰,胞浆着色均匀、胞间隙正常.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见心肌细胞肿胀,伴有变性和坏死,心肌纤维排列紊乱或断裂、呈长呈波浪形,纤维间距增宽,间质水肿、充血(如图1所示).

图1 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠心脏组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.8 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠肝组织形态学的影响

正常组小鼠肝组织结构正常、肝小叶完整清晰,肝血窦结构规整,胞浆未见脂肪变性、坏死等现象,核质分布均匀.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后小鼠肝组织损伤严重,可见灶性或片状坏死及脂肪变性,肝细胞索排列紊乱(如图2所示).

图2 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠肝组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.9 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠胃组织形态学的影响

正常组小鼠胃黏膜完整、黏膜层结构完成连续,胃小凹结构和腺体排列整齐,单层柱状上皮细胞排列整齐紧密,上覆黏液.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见小鼠胃黏膜层结构排列紊乱,部分腺体破坏;部分固有层裸露,胃底腺破坏,黏膜下层出现明显充血、水肿和炎性细胞浸润(如图3所示).

图3 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠胃组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.10 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠小肠组织形态学的影响

正常组小鼠小肠黏膜光滑完好,黏膜上皮形态结构完整,无破损脱落,细胞间连接紧密,杯状细胞及腺体排列整齐.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见黏膜萎缩、绒毛断裂,固有层结构不清,可见炎细胞浸润,黏膜下层呈现弥散性肿胀、充血,杯状细胞及腺体减少、排列紊乱(如图4所示).

图4 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠小肠组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.11 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠肾脏组织形态学的影响

小鼠肾小球基底膜厚度均匀、排列规则,肾小囊体积、囊腔腔隙正常,上皮细胞、足突细胞排列有序.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见小鼠肾小球结构紊乱、萎缩,基底膜不均匀增厚;肾小管片状坏死,肾小囊囊腔变小,上皮细胞排列紊乱,可见水肿变性、脱落,足突细胞大量融合(如图5所示).

图5 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠肾脏组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.12 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠卵巢组织形态学的影响

正常组雌性小鼠卵巢组织内各级发育卵泡及多个黄体组织,卵泡内卵母细胞、卵丘清晰可见,颗粒细胞呈8～9层.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见小鼠卵巢组织内多呈囊性扩张卵泡,卵泡内卵母细胞、卵丘消失,颗粒细胞排列疏松、呈2～3层,正常形态各级细胞少见,黄体组织数目较少(如图6所示).

图6 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对雌性小鼠卵巢组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.13 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠睾丸组织形态学的影响

正常组雄性小鼠睾丸曲细精管和生精上皮结构清晰、排列整齐,间质细胞结构正常、胞质丰富,曲细精管内可见各级排列有序的生精细胞,管腔中有大量生成的精子.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见小鼠睾丸内曲细精管排列疏松、紊乱,管腔内上皮细胞成团脱落,曲细精管之间间质细胞数量减少、呈弥散状分布,生精细胞数量显著减少,管腔中成熟精子数量减少(如图7所示).

图7 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对雄性小鼠睾丸组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.14 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对雄性小鼠附睾组织形态学的影响

正常组雄性小鼠附睾管发育良好、黏膜上皮光滑完整,主细胞排列整齐规则、游离面有成簇的静纤毛,细胞质红染、胞核圆润,附睾管腔内可见大量精子.用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后可见小鼠附睾管内上皮细胞和主细胞排列疏松、紊乱,游离面静纤毛减少或消失,胞核形状不规则、核染色加深而小,附睾管管腔内仅见少量精子(如图8所示).

图8 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对雄性小鼠睾丸组织形态学的影响(HE染色,×100)

2.15 碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠其他脏器组织形态学的影响

病理组织学分析结果表明,与正常组比较,用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后小鼠脑、脾、肾上腺肉眼及镜检均无病理性改变,表明碳酸二甲酯腹腔注射染毒后对小鼠上述脏器未见明显的毒副作用.

3 讨 论

碳酸二甲酯作为EG合成过程中的重要副产物,临床观察发现它侵入人体的途径主要为呼吸道、消化道、皮肤,对中枢神经系统有麻痹作用,对眼结膜、呼吸道黏膜和皮肤有刺激作用[4].由于国外生产安全防护控制标准较为严格,因此尚未有碳酸二甲酯中毒的报道.而国内由于EG工业化生产起步较晚,安全防护措施不足,导致职业性急性碳酸二甲酯中毒伤害时有发生,因此,迫切需要了解它在厂区空气中职业接触限值标准、对劳动者可能造成的伤害等,在此基础上建立一套切实有效的安全防护措施,以确保EG一线生产职工的生命安全.

c TnI和CK-MB是诊断心肌损伤的重要标志物,当心肌细胞遭受到化学、生物或缺血、缺氧刺激时,心肌细胞膜结构受损,使得胞浆内c TnI和CK-MB迅速释放入血液,进而导致血液中c TnI和CK-MB水平异常升高;此外,在心肌损伤病情未得到改善或者加重时,血液中c TnI和CK-MB也会处在高水平状态.因此,通过分析血液中c TnI和CK-MB可判断心肌损伤程度、预测治疗效果[5].实验中发现小鼠用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后血液中c TnI和CK-MB水平明显升高,此结果与P-R间期、QRS波、J点及心率的异常变化和心脏脏器系数升高,心肌细胞肿胀、变性和坏死及心肌纤维排列紊乱或断裂、间质水肿、充血的形态学损伤结果相一致.

AST和ALT是肝细胞损伤最敏感和特异的指标,当肝脏损伤时,肝细胞膜的通透性明显增加,存在于胞浆内AST和ALT就会快速释放入血液,使得血液中AST和ALT水平快速升高;此外,血液中LDH、ALP主要来自于肝脏,它们在肝细胞受损时,也会通过受损的细胞膜释放进入血液中[6].本研究结果显示,小鼠用碳酸二甲酯腹腔注射染毒后肝脏脏器系数高于正常组,血液中AST和ALT、ALP和LDH活性也均高于正常组,提示碳酸二甲酯腹腔注射染毒具有肝脏毒性,可导致肝细胞排列紊乱,可见灶性或片状坏死等器质性改变和肝功能受损.

在临床报道的急性碳酸二甲酯中毒病例中,急性肾衰竭和生殖系统毒性为其主要表现之一.在实验中发现碳酸二甲酯腹腔注射染毒小鼠的肾脏脏器系数,血液中BUN、CREA含量也明显高于正常组,提示碳酸二甲酯具有较强的肾脏毒性.肾脏组织形态学显示肾组织损伤严重,肾小管上皮细胞水肿、排列紊乱,肾小管灶性或片状坏死,肾小球结构紊乱,且呈现明显的剂量依赖关系.在生殖系统的形态学分析中,发现雌性小鼠卵巢组织中卵泡内卵母细胞、卵丘消失,颗粒细胞排列疏松、层数降低,黄体组织数目较少;雄性小鼠睾丸内曲细精管排列疏松、紊乱,管腔内上皮细胞脱落成团,曲细精管之间的间质细胞、生精细胞数量显著减少,生精细胞数量和成熟精子数量减少;附睾管内上皮细胞和主细胞排列紊乱,主细胞游离面静纤毛较少,胞核小而不规则,管腔内仅见少量精子.以上结果与Anderson等[7]报道的碳酸二甲酯生殖系统毒性相一致.

在实验中,还观察到腹腔注射染毒碳酸二甲酯后,可显著引起胃和小肠上皮细胞脱落坏死、黏膜下层明显充血、水肿等器质性损伤.上述损伤的出现可能是碳酸二甲酯染毒后通过血液循环所致,同时也表明消化损伤也是碳酸二甲酯产生毒性损伤的靶器官之一.同时,还发现血液中 WBC、LYM、EOS、BASO、MONO、RBC、PLT、NEU 数目和 HGB含量较正常组也均出现了异常改变.据此推测碳酸二甲酯可能是对血液系统造成伤害,或者是由于碳酸二甲酯抑制了小鼠的正常进食、饮水,影响了血细胞的产生所致.

综上所述,碳酸二甲酯腹腔注射染毒具有较强的毒性,可引起实验小鼠心电图异常、血液中c TnI水平、血液学和血生化指标异常改变,可导致心、肝、胃、小肠、肾和卵巢、睾丸出现器质性病变.本实验为EG合成过程中产生碳酸二甲酯副产物的职业危害防治提供实验依据.