地西他滨逆转人乳腺癌细胞中miR-5047基因甲基化状态的研究

楚元奎，路玉祥，方丹丹，杨 丽，李 元，郭 乐，杨 华

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，研究显示，2018年全球乳腺癌的年患病人数超过208万，死亡数超过62万[1]。2019年国家癌症中心发布的最新统计数据显示，2015年我国乳腺癌的新发病例约为30.4万，位列女性恶性肿瘤的首位。寻找有效的分子诊断和治疗靶点对于提高乳腺癌的早治早诊率和乳腺癌患者的生存率具有重要意义。微小RNA(miRNAs)在乳腺癌的发生发展过程中扮演着重要的角色[2]。研究证实抑癌miRNAs的沉默与其启动子区的高甲基化状态有关[3]；地西他滨(5-杂氮-2′脱氧胞苷酸，DAC)是一种去甲基化药物，可有效逆转抑癌miRNAs启动子的高甲基化状态，促进抑癌miRNAs的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长[4-5]。本研究拟通过qRT-PCR和甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)检测明确乳腺癌细胞中miR-5047的表达水平及其启动子的甲基化状态，以及地西他滨处理对miR-5047启动子甲基化状态和miR-5047表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 细胞株：MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 主要试剂：DMEM培养基(Gibico公司)，胎牛血清(BI公司)，Trizol试剂、DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，EpiTect Bisulfie kit(Qiagen公司)，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme 公司)，miR-5047启动子MSP、miR-5047和U6检测引物(上海生工生物工程有限公司)，地西他滨和二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理： MCF-7和MDA-MB-231细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养液，MCF-10A细胞培养于人乳腺上皮细胞完全培养液(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。上述细胞均置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后实验组分别加入终浓度为5 μmol/L和10 μmol/L的地西他滨；……