探讨脑胶质瘤中IDH1/2、TERT 基因分布的相关性及其意义

李秋燕，黄发明，张凯元，谷云艳，莫彦妮，夏春波，朱琳*

（1.桂林医学院临床医学院，广西 桂林 541000；2.桂林医学院附属医院病理科，广西 桂林 541000；3.桂林医学院基础医学院，广西 桂林 541000）

0 引言

在中枢神经系统原发性恶性肿瘤中，具有高发病率和高病死率等特点的胶质瘤是最常见的。目前我国胶质瘤发病率呈现逐年上升趋势，尽管通过结合手术、放化疗和其他辅助治疗进行治疗可以取得一定的疗效，但高级别胶质瘤患者的预后仍然令人沮丧，中位生存期仅为10 至15 个月[1]。在过去的十年里，神经胶质瘤的分子特征有了显著的发展。分子标记是2016 年世界卫生组织（WHO）给中枢神经系统肿瘤分类增加的新组成部分，对胶质瘤的临床病理诊断和预后产生深远影响[2]。Parsons 等[3]在2008 年，通过对蛋白质编码基因的研究测序和分析，最先发现异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）的基因突变在胶质母细胞瘤中大约占比12%。随之，越来越多的研究人员逐渐发现在低、高级别胶质瘤以及继发性胶质母细胞瘤中IDH1/2 突变普遍存，可作为其初步判断预后结果的标志，并在肿瘤的发生、发展以及演变过程发挥着重要作用。胶质瘤中另一个重要的突变是端粒酶逆转录酶（TERT）突变[4]，包括C228T 和C250T 两种类型，TERT 基因启动子突变会导致不良预后[5]。目前已经发现对于神经胶质瘤诊断、治疗和预后起着积极意义的分子标志物有异柠檬酸脱氢酶（IDH）、端粒酶逆转录酶（TERT）、1p19q、表皮生长因子受体（EGFR）、O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（MGMT）等。本研究旨在探究IDH1/2，TERT 基因启动子区突变在不同病理级别脑胶质瘤中分布的联系性及意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

采集2016 年1 月至2019 年12 月在桂林医学院附属医院神经外科行脑胶质瘤切除术并且经病理确诊为脑胶质瘤患者的60 例肿瘤组织标本及尸检获取的正常脑组织标本各30例，其中胶质瘤患者年龄为22 岁至71 岁，平均44.8 岁；尸检患者年龄为0 岁至78 岁，平均43.0 岁。患者术前均未接受过放疗和化疗，排除病理质量较差的病例及合并其他恶性肿瘤的标本。标本均经桂林医学院附属医院病理科2名经验丰富的医师进行诊断并确诊为脑胶质瘤，根据研究目的按照2016 版WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准将标本分为高级别组（Ⅲ级、Ⅳ级）和低级别组（Ⅰ级、Ⅱ级）以及正常组（正常脑组织），如图1 所示，其标本数量依次分别为37 例，23 例和30 例。

图1 不同病理级别脑胶质瘤HE 染色

IDH1/2 基因突变与TERT 基因启动子区突变检测

1.1.1 脑胶质瘤组织样本DNA 的提取

①参照北京泛生子生物科技有限公司提供的试剂说明书准备好60 例胶质瘤和30 例尸检标本的蜡卷各10 卷，编好号后依次置于1.5mL 无菌离心管中，向离心管内加入1mL 二甲苯，剧烈涡旋离心后弃上清。②将1mL 无水乙醇加入上述管中，涡旋混匀离心后弃上清，待乙醇挥发后加入200μ1 缓冲液GA 和20μl Proteinase K 进行孵育裂解。③在上管中加入220μl 缓冲液GB 和250μl 无水乙醇，涡旋震荡短暂离心后将混合液转移至对应的吸附柱CR2 中并进行离心。④倒掉废液，重新将吸附柱放回收集管中并向吸附柱CR2 中加入500μl 缓冲液GD，离心后倒掉收集管中的废液。⑤加600μl漂洗液PW 于吸附柱CR2 中，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱开盖晾干残余漂洗液。⑥将吸附柱CR2 转入一个对应编号的干净离心管中，悬空滴加65℃预热的60μl 洗脱缓冲液TE 后离心，收集到相应样本DNA。

1.1.2 实时荧光定量PCR 技术检测IDH1/2 基因突变与TERT 基因启动子区突变

①使用分光光度计检测待检样本DNA 浓度。按照DNA浓度为10ng/L 的标准，用去离子水稀释待检样本，制成待检DNA 样品，并制备等体积的阴性对照品。②将融化好的检测试剂和阳性对照品短暂离心后置于冰上，制备等体积的阳性对照品。③往已装有待检DNA、阴性对照及阳性对照的PCR管中加入Taq DNA 聚合酶，混匀后短暂离心。④打开装有检测试剂的8 联管管盖，将待检DNA、阴性对照和阳性对照按3μ1/孔分别加至检测试剂的不同反应孔中，混匀后短暂离心立即上机检测。

1.2 统计学分析

本研究所涉及的统计学分析选用SPSS 20.0 统计软件进行。IDH1/2 基因突变和TERT 启动子基因突变在不同病理级别脑胶质瘤组织中的分布差异采用χ2检验，二者相关性选用Spearman 相关分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在不同病理级别脑胶质瘤中IDH1/2 基因突变的检测分布结果

IDH 基因突变型在60 例脑胶质瘤标本中共发现26 例（总突变率43.33%），包括高级别组37 例，突变型12 例（突变率32.43%）；低级别组23 例，突变型14 例（突变率60.87%）。检测结果显示在不同级别脑胶质瘤中IDH 基因突变的分布差异具有统计学意义（P＜0.001），详见表1。IDH 基因突变型与野生型扩增曲线图详见图2。

表1 IDH 基因突变在不同级别脑胶质瘤中的分布情况表

图2 IDH 基因突变型与野生型扩增曲线图

2.2 在不同病理级别脑胶质瘤中TERT 基因启动子区突变的检测分布结果

TERT 基因启动子区突变型在60 例脑胶质瘤中发现共有32 例（总突变率53.33%），其中23 例C228T 位点突变，9例C250T 位点突变。高级别组37 例，突变型17 例（突变率45.95%）；低级别组23 例，突变型15 例（突变率65.22%）。检测结果表明，低级组的TERT 基因启动子突变的分布明显高于高级组和正常组，差异有统计学意义（P＜0.001），见表2；TERT 基因启动子突变型与野生型扩增曲线图详见图3。

表2 TERT 基因启动子区突变在不同级别脑胶质瘤中的分布情况表

图3 TERT 基因突变型与野生型扩增曲线图

2.3 IDH 基因突变与TERT 基因启动子区突变相关性分析

我们通过进一步Spearman 相关分析，探究了IDH 基因突变与TERT 基因启动子区突变的相关关系，发现IDH 基因突变、TERT 基因启动子区突变呈负相关（r=-0.396，P＜0.01）。详见表3。

表3 IDH 基因突变与TERT 基因启动子区突变的相关性

3 讨论

高级别胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的最具侵袭性和致命性的弥漫性恶性肿瘤[6]，其总体生存期并不长[7]。目前临床上胶质瘤的主要治疗方式仍然是依赖手术切除结合术后化疗，但是其治疗的总体效果较差，生存时间短，生活质量大大降低。所以，找到有效的治疗策略和方法去提高患者的生存质量和时间。目前新的分子标记物的出现为胶质瘤的诊断、预后及改善生存率提供了可能，近年来的热门研究课题也逐渐向IDH1/2 基因突变和TERT 基因启动子突变倾斜，并且其也是分子标记研究相对较多、较熟悉且有价值的领域。IDH 是三羧酸循环中关键限速酶，研究多次证明IDH1/2 与肿瘤的发生、发展、预后相关，梁博等[8]发现，具有IDH1 突变的胶质母细胞瘤的患者总生存期比野生型长，这也间接证实了IDH1 基因突变可能会与神经胶质瘤的发生和预后密切相关。同时，研究发现IDH1/2 突变相对独立并且相互排斥，同时发生的情况并不多见[9]。此外，发现IDH 基因突变与胶质瘤的病理分型也可能存在某种联系，在鉴别与诊断上起到重要意义[10-13]，与本研究结果在不同级别脑胶质瘤中IDH 基因突变的分布存在差异一致。另有研究表明IDH 基因突变可作为临床医生发现早期胶质瘤患者的提示，这也就对于确诊患者为神经胶质瘤和其肿瘤分级以及预估术后脑胶质瘤患者生存时间同样是具有重要参考价值。

TERT 基因启动子区突变最先在黑色素瘤中发现[14]，其后证实在脑胶质瘤中也存在TERT 基因启动子区突变[15]，对胶质瘤的形成和发展起重要作用[16]。突变后的TERT 能够产生两个结构相同的启动子结合域，使转录活性成倍的增加,进而使端粒酶的活性增强并抑制肿瘤细胞的凋亡[17-18]。Nonoguchi 等人[19]研究发现TERT 启动子突变多位于C228T和C250T，且C228T 突变患者预后差于C250T 突变。另有研究表明端粒的维持可能是脑癌形成的必要前提[20]，在WHOⅡ级和胶质母细胞瘤中具有一定的预后评估价值[21]。本研究中，在60 例脑胶质瘤中有32 例发生TERT 基因启动子区突变，其中23 例发生C228T 位点突变，9 例发生C250T 位点突变，且在低级别组中的突变率明显高于高级别组及正常组，提示突变可能对患者预后提供评估价值。

Nonoguchi 等[19]研究发现TERT 基因突变和IDH1 基因突变存在互斥现象，认为TERTp-mut 对肿瘤不良预后的预测价值很大程度上是得益于其与IDH1/2 突变的负相关性。本研究结果显示IDH 基因突变与TERT 基因启动子区突变存在明显负相关，与上述研究结果相似。Killela 等[22]和Zachary等[23]研究表明TERT 启动子区突变和IDH1/2 突变在不同亚型的胶质瘤中也明显存在着分布差异。有研究[24]发现同时存在IDH1/2 突变和TERT 启动子区突变时高级别胶质瘤患者的个体生存期最长，其次为仅存在IDHI/2 突变的研究组，预后较差的是无两者中任何突变和仅存在TERT 启动子区突变的患者。这种现象可能与IDH1 突变和TERT 基因启动子突变的协同作用有一定的联系。它们互相影响于彼此的下游信号通道，并使TERT 启动子的转录活性下降。因此，TERT基因突变的患者预后较差。

本研究结果显示在脑胶质瘤中IDH1/2 基因突变与TERT基因启动子区突变存在明显相关性，但是仍旧需要进一步的实验以确认它们之间的相互作用，并探讨IDH1/2 基因突变与TERT 基因启动子区突变在胶质瘤发生、发展的作用机制，以期发现更多肿瘤标志性基因以及靶向用于临床。目前虽然IDH1/2 和TERT 基因等分子靶向基因检测尚处于早期阶段，但随着更深入的研究，快速、低价和精准的分子手段一定会为临床治疗提供新的途径和方法，提高脑胶质瘤患者的生活质量以及改善预后，推进胶质瘤患者的个体化治疗。