柴胡对对乙酰氨基酚及其毒性相关代谢产物体内动力学影响

吴殷囡，汪玉馨，杜益，杨方秀，宗卫峰，孟长虹，谭力，陆益红*（.徐州医科大学药物分析教研室，江苏 徐州 004；.江苏省食品药品监督检验研究院，南京 009；.浙江省中医院药剂科，杭州 0006）

对乙酰氨基酚（APAP）的过量使用易致严重的肝损伤甚至死亡，因此APAP 及其代谢产物的研究和监测对于肝损伤风险的防范尤为重要。近年来，国内外研究者对于APAP 的体内过程及其毒性产物、转化过程等方面研究较为充分。正常剂量下，APAP 进入体内后经CYP450 酶代谢生成活性中间体N-乙酰-对-苯醌亚胺（NAPQI），其在谷胱甘肽转移酶的作用下生成谷胱甘肽结合物而排出体外。但当过量服用APAP 时，因NAPQI 在体内大量产生而耗竭谷胱甘肽（GSH），过量的NAPQI 则会结合肝细胞蛋白从而导致肝细胞损伤[1-5]。

在中药配伍减毒增效的研究中发现，药物联用产生的减毒作用主要表现在对药物体内过程的影响，通过影响药物及其毒性产物的体内过程（包括吸收、代谢及排泄等），从而影响药物的毒性[6]。课题组前期研究发现，柴胡及其制剂正柴胡饮对APAP 所致的肝损伤有预保护作用，从药动学角度来看，推测柴胡预保护作用的发挥可能与降低APAP 的入血浓度或减少APAP 毒性相关代谢产物NAPQI 的产生有关[7]。

因此，本实验以APAP 及其毒性相关代谢产物为研究对象，建立HPLC-MS/MS 检测法，通过柴胡水提液预给药后给予APAP，考察柴胡水提液对APAP 代谢物转化的影响，以期为APAP 及其毒性相关代谢产物的测定及后续机制研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪，包括Finnigan TSQ Quantum Discovery Max 系统Xcalibur 1.2 数据采集软件和LCQuan 数据处理软件（美国Thermo 公司）；XP6 型/XS205DU 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；ZH-2 型自动涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）；真空离心浓缩挥干仪（美国Thermo 公司）；L-550 台式低速离心机（湖南湘潭离心机有限公司）；Beckman Coulter Allegra 64R 台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.2 试药

对乙酰氨基酚[APAP，纯度≥ 99%，批号：G1816129，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸钠盐（APG，纯度≥99%，批号：3-NAV-128-3）、对乙酰胺氨基酚半胱氨酸三氟乙酸盐（APC，纯度≥99%，批号：1-PQY-180-1）（Toronto Research Chemicals 公司）；茶碱（内标，纯度≥99%，批号：YJX6-F86M，中国食品药品检定研究院）；羧甲基纤维素钠（CMCNa）（上海沪试实验室器材股份有限公司）；甲酸（Sigma-Alorich 公司）；乙腈、甲醇（Fisher 公司）；超纯水由Millipore 超纯水机制备。

1.3 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠，体质量（200±20）g[北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证为：SCXK（京）2016-0006]。动物饲养于屏障系统内，实验期间动物自由进食、饮水，昼夜节律正常。

2 方法

2.1 色谱条件

Waters Xselect HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm），柱温35℃，进样体积5 μL，流速200 μL·min－1，流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱：0 ～5 min，45%A；5 ～9 min，12%A；9 ～11 min，45%A。

2.2 质谱条件

电喷雾电离离子源（ESI）；多反应监测扫描模式（MRM）；喷雾电压为 3.8 kV；毛细管温度为 350 ℃；鞘气压力为 35 psi；辅助气流量为 5 arb，各化合物MRM 参数见表1。

表1 质谱优化条件Tab 1 Mass spectrometry optimization conditions

2.3 溶液的制备

精密称取APAP、APC、APG 对照品适量，用甲醇溶解并稀释，分别制备成质量浓度为5、0.1、5 mg·mL－1的储备液；精密称取茶碱对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制备成质量浓度为0.5 mg·mL－1的储备液，于4℃保存备用。

2.4 样品前处理

取100 µL 待测血浆于1.5 mL EP 管中加入沉淀剂[0.1%甲酸甲醇溶液∶乙腈＝1∶1（V/V），含内标茶碱的终质量浓度为600 ng·mL－1] 300µL，涡旋3 min，18 000 g 高速离心10 min，取上清液200 µL，真空离心挥干。进样分析前，各分析样品以200 μL 的流动相复溶，涡旋3 min后，18 000 g 4 ℃离心5 min，取上清液置自动进样瓶中进行LC-MS/MS 分析。

2.5 分析方法验证

2.5.1 专属性 取100 μL 空白血浆按“2.4”项下方法以等量不含内标的空白沉淀剂沉淀蛋白，取100 μL 空白血浆加入20 μL 3 种受试物质的混合对照品（APAP 为800 ng·mL－1，APC 为12 ng·mL－1，APG 为800 ng·mL－1）以及100 μL 给药后血浆（5 h）按“2.4”项下方法加入含内标的沉淀剂沉淀蛋白，离心挥干复溶处理后，LC-MS/MS 进样分析。比较空白血浆、空白血浆加混合对照品以及给药后血浆的MRM 色谱图，以考察方法的专属性。结果表明，所建方法专属性较高，分离较好，生物介质中的杂质峰不干扰样品峰的测定（见图1）。APAP、APC、APG 以及茶碱的保留时间分别为3.18、2.22、2.01 和3.65 min。

图1 空白血浆（A），空白血浆＋对照品＋内标（B）及给药后血浆样品（C）中APAP、APC 和APG 的LC-MS/MS 色谱图Fig 1 LC-MS/MS chromatogram of blank plasma（A），blank plasma ＋control ＋IS（B），and plasma sample after administration（C）

2.5.2 线性范围 取100 μL 空白血浆，加入不同浓度APAP、APC、APG 的混合对照溶液20µL，使APAP 质量浓度分别为100、200、800、1600、6400、12 800、51 200、102 400 ng·mL－1，APC 质量浓度分别为1.5、3、12、24、96、192、768、1536 ng·mL－1，APG 质量浓度分别为100、200、800、1600、6400、12 800、51 200、102 400 ng·mL－1，按“2.4”项下方法处理，进样分析。以混合对照溶液质量浓度（x，ng·mL－1）为横坐标，以对照品峰面积与内标峰面积的比值（y）为纵坐标，进行最小二乘法回归，权重系数为1/χ。APAP 及其毒性相关代谢产物APC、APG 在血浆中的回归方程、相关系数及线性范围见表2。

表2 分析物的线性范围、回归方程和相关系数Tab 2 Linearity，regression equation and correlation coefficients of analytes

2.5.3 定量限 标准曲线的最低浓度点定义为最低定量限（LLOQ），该点的精密度应小于20%，其准确度（RE%）应介于－20%～20%。APAP及其毒性相关代谢产物APG、APC 回归方程具有良好的线性系数（r2＞0.99），其最低浓度精密度和准确度均符合要求，见表3，故将其最低浓度定义为LLOQ，APAP、APC 和APG 的定量限分别为100、1.5 和100 ng·mL－1。

2.5.4 精密度和准确度 取100 μL 空白血浆，按“2.5.2”项下方法配制终质量浓度，APAP 为100、800、6400、51 200 ng·mL－1，APC 为1.5、12、96、768 ng·mL－1，APG 为100、800、6400、51 200 ng·mL－1的血浆标准样本，按“2.4”项下方法进行处理，每个浓度均重复5 份，连续测定3 批，计算样品的浓度，进行日间（n＝5）及日内（n＝5）的准确度和精密度考察，结果见表3。真实值与测定值的偏差程度在±15%内，测定平均值与测定值的偏离程度（RSD%）低于15%，符合生物样品测定的要求。

表3 血浆中分析物的日内和日间准确度、精密度Tab 3 Intra-and inter-day accuracy，precision of analyte in the plasma

2.5.5 提取回收率及基质效应 取100 μL 空白血浆，按下述两种方式处置：① 按“2.5.2”项下方法配制APAP 质量浓度为100、800、6400、51 200 ng·mL－1，APC质量浓度为1.5、12、96、768 ng·mL－1，APG 质量浓度为100、800、6400、51 200 ng·mL－1的血浆标准样，获得相应的峰面积（A），按“2.4”项下样品处理方法处理后进样分析；② 按“2.4”项下方法处理后在复溶液中加入3种受试物质的混合对照品溶液，使体系中的终浓度与上述对照品样本相同后进样分析，获得相应的峰面积（B）；③ 同时以等量超纯水代替空白血浆，依方式②处置，与空白介质样本平行操作，进样分析得相应的峰面积值（C）。提取回收率以A/B（%）计算表示，基质效应以B/C（%）计算表示。

血浆中的提取回收率及基质效应的结果见表4。APAP、APC、APG 的基质效应介于 87.46%～103.43%。APAP、APC 和APG 的提取回收率分别为90.12%～100.66%、87.61%～99.64%和86.59%～94.20%，表明3 种物质在所建立的样品处理条件下提取回收率良好，且基本无基质干扰。

表4 血浆中分析物的基质效应和提取回收率(n ＝5，%)Tab 4 Matrix effect and extraction recovery of analyte in the plasma (n ＝5，%)

2.5.6 稳定性 取100 μL 空白血浆，按“2.5.2”项下方法配制终质量浓度APAP 为800、6400、512 00 ng·mL－1，APC 为12、96、768 ng·mL－1，APG 为800、6400、512 00 ng·mL－1的血浆标准样本，分别考察室温放置8 h，冷冻（－80℃）-解冻（37℃）循环3 次，－80℃存放1 周在样品盘内（4℃）放置24 h 的稳定性。结果表明，APAP、APC、APG 均具有较好的稳定性（见表5）。

表5 血浆中QCs 浓度下分析物的稳定性Tab 5 Stability of analyte at QCs concentration in the plasma

3 药动学考察

3.1 药物制备

3.1.1 柴胡水提液 称取适量北柴胡生药饮片，浸泡30 min，首次加10 倍水煎煮1.5 h，第二次加8.5 倍水煎煮1.5 h，将所得药汁水提醇沉24 h后过滤，得到柴胡水提液，每1 mL 水提液含生药3.8 g（本提取液由南通精华药业公司协助制备）。

3.1.2 APAP 溶液的制备 称取APAP 适量，研细，以5%CMC-Na 为溶媒使其分散均匀，制备浓度为60 mg·mL－1的APAP 混悬液。

3.2 分组及给药

大鼠实验前于实验室屏障系统内喂养1 周，每日给予食物与饮用水，APAP 给药前禁食12 h，饮水自由。将24 只大鼠按体重随机分为4 组，包括溶媒对照组（5% CMC-Na）、APAP 对照组（1.2 g·kg－1）、柴胡低剂量（6 g·kg－1）预给药组、柴胡高剂量（25 g·kg－1）预给药组。溶媒对照组和APAP 对照组前3 d 给予0.9%氯化钠溶液，每日一次；预给药组前3 d 以各剂量的柴胡水提液灌胃，每日一次。于第3日末次给药6 h 后按体重以1.2 g·kg－1给予APAP，对照组给予5%CMC-Na 溶液。

3.3 生物样本采集及处理

依次于APAP 给药后的5 min、10 min、20 min、40 min、1 h、2、3、5、10、24、31、48 h 于大鼠眼底静脉丛取血200 μL 置含肝素化的1.5 mL EP 管中，3000 g 离心10 min，吸取上清血浆，于－80℃冰箱保存。测定时，按“2.4”项下方法处理后进样分析。

3.4 统计分析

采用Thermo TSQ Quantum Access 定量处理软件处理并计算各物质的浓度。根据测定结果考察不同组别APAP 及其毒性相关代谢产物的血药浓度-时间曲线，并利用DAS 3.2.7 软件（中国数学药理专业委员会）对不同组别的血药浓度数据进行分析，按照非房室模型计算药动学参数，包括药时曲线下面积（AUC0→t）、峰浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）、半衰期（t1/2）、清除率（CL）以及平均驻留时间（MRT0→t）。不同给药组间的数据使用Graphpad Prism 5 软件进行独立样本间的两两t检验，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

4 结果

根据测定结果考察不同组别中APAP 及其毒性相关代谢产物的血药浓度-时间曲线，比较了不同组别药动学参数，由表6可知，预给药3 d 柴胡低、高剂量预给药组（3RBL ＋APAP，3RBH ＋APAP）中，APAP 毒性中间体谷胱甘肽结合物NAPQI-GSH的水解产物APC、Ⅱ相葡萄糖醛酸结合物APG 与APAP 的峰浓度存在显著差异。

表6 APAP 及其毒性相关代谢物的药动学参数(平均值±标准偏差，n ＝5)Tab 6 Pharmacokinetic parameters of APAP and its toxicity related metabolites (mean±SD，n ＝5)

通过对曲线及参数的综合分析可以看出，与APAP 组相比，柴胡低、高剂量预给药组，APAP及其毒性相关代谢产物在大鼠体内的血药浓度-时间曲线及AUC0→t均无显著差异，但柴胡高剂量预给药组，APAP 的Cmax体内暴露水平有所下降，但差异无显著性。在柴胡低、高剂量预给药组，Ⅱ相葡萄糖醛酸结合物APG 的Cmax则显著升高；APAP 毒性中间体谷胱甘肽结合物NAPQIGSH 的水解产物APC 的Cmax显著下降，提示NAPQI-GSH 及NAPQI 的Cmax出现短时下降，表明APAP 所致急性损伤的减毒作用可能与其活性体NAPQI 短时暴露量的降低有关（见图2）。

图2 雄性Wistar 大鼠APAP（A）、APC（B）、APG（C）的血药浓度-时间曲线和药动学参数Fig 2 Plasma concentration-time profiles and pharmacokinetic parameters of APAP（A），APC（B）and APG（C）in male Wistar rats

5 讨论

大量文献表明，APAP 毒性作用的产生是由于经CYP450 酶代谢生成的活性中间体NAPQI 在体内大量蓄积因GSH 的耗竭而导致与肝细胞蛋白结合引起肝损伤，正常剂量下，85%～90%的APAP 通过葡萄糖醛酸化或硫酸化生成Ⅱ相代谢产物由尿液中排出体外，而＜10%的原形药物则经Ⅰ相代谢产生NAPQI 后形成NAPQI-GSH，并迅速水解生成APC 转化为无毒代谢产物[8-11]。由于APAP 毒性代谢产物NAPQI 为活性中间体不稳定，同时未能得到NAPQI-GSH 对照品，且有研究表明急性肝损伤患者血浆中APC 浓度与血生化指标成正相关，其可作为标志物表征APAP 肝损伤的毒性代谢过程[12-14]，因而考察柴胡预给药对APAP 及其相关代谢产物的影响。

实验结果表明，高剂量柴胡预给药后降低了APAP 在体内的峰浓度，一方面通过增加Ⅱ相代谢葡萄糖醛酸化产物APG 的生成，加速其排泄过程，从而减少APAP 向NAPQI 的转化；另一方面发现APC 的峰浓度下降具有显著性差异，推测可能由于APAP Ⅱ相代谢产物转化的增加使其受到影响，同时也可能由于NAPQI 活性中间体的减少致使NAPQI-GSH 下降影响下游代谢产物APC 水平，其中Cmax下降至关重要，避免了短时内NAPQI 的大量蓄积、耗竭GSH 而产生肝毒性的可能。由于Ⅰ相代谢与NAPQI 的产生直接相关，为探究柴胡对APAP 的减毒作用机制，有必要对APAP Ⅰ相代谢相关的CYP450 酶进行下一步研究。