尾静脉注射BA/F3-JAK2V617F细胞构建BALB/c小鼠真性红细胞增多症模型

石镇港，夏伟，刘学武，冯璐瑶，冯超，赵丞，姜德建，信红亚（1.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，长沙 41008；.湖南省药物安全评价研究中心，新药药效与安全评价湖南省重点实验室，长沙 410331；3.中南大学湘雅医院血液科，长沙 410008）

真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）是一种Ph 阴性骨髓增生性肿瘤疾病，其全球性群体发病率为8.4×10－6[1]。PV 的主要特征为二系或三系骨髓细胞过度增殖，临床表现为以红细胞计数升高为主的二系或三系血细胞计数升高，通常伴有肝脾肿大、出血与血栓形成，末期可进展为骨髓纤维化疾病[2]。随着JAK2V617F基因突变的发现，研究者对PV 的发病机制有了更深的了解，目前PV 患者中约95%存在JAK2V617F或JAK2外显子12 号基因突变[3-4]。现阶段研究人员主要是通过转基因、基因敲入或注射转染JAK2V617F突变基因细胞等方法构建JAK2V617F突变的PV 疾病动物模型[5-8]。与注射转染JAK2V617F突变基因细胞方法相比，转基因及基因敲入建立PV 模型存在耗时长、成本较高等缺点，因此本研究采用尾静脉注射JAK2V617F突变细胞，构建BALB/c 小鼠PV 模型，模拟PV 全身播散的生物学特点，探讨PV 模型建立方法以及细胞量对PV 动物模型建立的影响，为今后研究PV 治疗提供模型基础。

1 材料

1.1 实验动物及预处理

SPF 级BALB/c小鼠40只，雌性，5 ～6 周龄[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2011-0003；饲养于湖南省药物安全评价研究中心屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2015-0016]。所购小鼠于SPF 级动物房内常规饲养1 周，标准颗粒饲养，饮水、垫料及一切与鼠接触的物品均经灭菌处理。接种前动物接受1.0 Gay 剂量的全身辐照，预处理后24 h 内尾静脉接种细胞。

1.2 试药与仪器

BA/F3 完全培养基、BA/F3 细胞（上海复祥生物科技有限公司）；JAK2V617F质粒（载体为pCDH-CMV-MCS-COpGFP-T2A-Puro）、空白载体质粒及慢病毒（武汉中迈盈科生物科技有限公司构建并包装）；磷酸芦可替尼片（AG，规格：5 mg/片，批号：SCU66）；BC-5800 型五分类血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）；ME2002E 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；RM2235 型石蜡切片机、TP1020 型全自动脱水机、ED1150H ＋C 型组织包埋机、DFC420C 病理成像系统、DM2000 型生物显微镜（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 实验分组及给药方法

BA/F3 细胞复苏后置于含有10%胎牛血清的完全培养基（含10 ng·mL－1的白介素3）中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，2 ～3 d 换液传代一次。收集对数生长期细胞分别进行JAK2V617F慢病毒和空白载体质粒慢病毒转染，筛选JAK2V617F慢病毒、空白载体质粒慢病毒转染成功的细胞进行传代培养，细胞命名为BA/F3-JAK2V617F、BA/F3-Blank。雌性BALB/c 小鼠40只，随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、芦可替尼组，每组8 只。低剂量组、中剂量组、高剂量组、芦可替尼组分别经尾静脉注射密度为1×106、5×106、8×106、8×106个·mL－1的BA/F3-JAK2V617F细胞，0.2 mL/只，空白对照组尾静脉注射密度为8×106个·mL－1的BA/F3-Blank 细胞，0.2 mL/只，每日将芦可替尼配制成质量浓度为0.26 mg·mL－1的药液按20 mL·kg－1进行灌胃给药，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组给予等体积纯水，每日给药1 次，连续给药4 周。

2.2 数据处理与统计分析

采用SPSS 16.0 进行统计分析，统计学意义的水平设定为P≤0.05，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，用Leven’s test 方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析（ANOVA）和LSD test 进行统计分析；如果不符合正态性和方差齐性，则用Kruskal-Wallis 检验，如果Kruskal-Wallis 检验有统计学意义（P≤0.05），则用Dunnett’s test（非参数方法）进行比较分析，评价时考虑统计学差异和生物学意义。

2.3 观察指标

2.3.1 血液学指标 末次给药后，各组小鼠眼底静脉丛采血，0.2 mL/只，检测血液中白细胞（WBC）、红细胞（RBC)、血红蛋白（HGB）、红细胞比容（HCT）。

2.3.2 脾脏质量及脾指数 末次给药后，各组小鼠颈椎脱臼处死，解剖取脾脏并称重，按以下公式计算脾指数。

脾指数（mg·g－1）＝脾脏湿重（mg）/体质量（g）

2.3.3 骨髓涂片 解剖取胸骨，用镊子挤压胸骨，直至挤压出骨髓，对骨髓进行骨髓涂片，光镜下观察有核细胞计数变化。

2.3.4 组织病理学变化 解剖取脾脏、胸骨、股骨、腰椎，10%福尔马林固定，作组织病理学检查。

3 结果

3.1 血液学指标变化

如表1所示，与空白对照组比较，低剂量组HGB 明显升高（P≤0.01），中剂量组、高剂量RBC、HGB、HCT 均明显升高（P≤0.01），高剂量组RBC、HGB、HCT 显著高于低剂量组和中剂量组。与高剂量组比较，芦可替尼组RBC、HGB、HCT 均明显降低（P≤0.01）。

表1 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对血液学指标的影响( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s，n ＝8)

表1 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对血液学指标的影响( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s，n ＝8)

注：与空白对照组比较，##P ≤0.01；与高剂量组比较，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，##P ≤0.01；compared with the high dose group，**P ≤0.01.

组别 浓度/（个·mL－1） WBC/（×109·L－1） RBC/（×1012·L－1） HGB/（g·L－1） HCT/%空白对照组 8.0×106 8.76±1.17 6.71±0.83 140±11 47.3±4.3低剂量组 1.0×106 8.80±0.91 7.18±1.02** 166±19##** 49.1±3.1**中剂量组 5.0×106 8.56±1.02 10.50±1.88##** 195±14##** 58.3±5.0##**高剂量组 8.0×106 9.19±1.08 12.95±1.54## 222±23## 66.1±6.8##芦可替尼组 8.0×106 9.28±0.92 6.98±0.85** 149±18** 49.4±5.1**

3.2 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对脾脏质量及脾指数的影响

如表2及图1所示，与空白对照组比较，其余各组体质量明显下降（P≤0.05 或P≤0.01），中、高剂量组脾脏质量、脾指数明显增大（P≤0.01）。与高剂量组比较，低、中剂量组及芦可替尼组体质量均明显升高（P≤0.01），脾脏质量、脾指数均明显降低（P≤0.05 或P≤0.01）。

表2 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对体质量、脾脏、脾指数的影响( ±s，n ＝8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass，spleen and spleen index ( ±s，n ＝8)

表2 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对体质量、脾脏、脾指数的影响( ±s，n ＝8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass，spleen and spleen index ( ±s，n ＝8)

注：与空白对照组比较，#P ≤0.05，##P ≤0.01；与高剂量组比较，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，#P ≤0.05，##P ≤0.01；compared with the high dose group，*P ≤0.05，**P ≤0.01.

组别 浓度/（个·mL－1） 体质量/g 脾脏质量/mg 脾指数/（mg·g－1）空白对照组 8.0×106 29.5±0.7 163±15 5.5±0.5低剂量组 1.0×106 28.5±1.5#** 175±19** 6.2±0.6#**中剂量组 5.0×106 25.5±1.0##** 202±38##* 7.9±1.5##**高剂量组 8.0×106 21.9±1.0## 225±17## 10.3±0.5##芦可替尼组 8.0×106 28.0±0.6##** 170±17** 6.1±0.6**

图1 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对脾脏的影响Fig 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the spleen

3.3 BA/F3-JAK2V617F 细胞对骨髓中有核细胞的影响

如表3所示，与空白对照组比较，其余各组骨髓中粒细胞系、粒红比明显减少（P≤0.05 或P≤0.01），中剂量组、高剂量组、芦可替尼组红细胞系明显增加（P≤0.05 或P≤0.01）。与高剂量组比较，芦可替尼组粒红比明显增加，红细胞系明显减少（P≤0.01）。

表3 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对骨髓中有核细胞的影响( ±s，n ＝8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s，n ＝8)

表3 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 细胞对骨髓中有核细胞的影响( ±s，n ＝8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s，n ＝8)

注：与空白对照组比较，#P ≤0.05，##P ≤0.01；与高剂量组比较，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，#P ≤0.05，##P ≤0.01；compared with the high dose group，*P ≤0.05，**P ≤0.01.

组别 浓度/（个·mL－1） 粒细胞系/% 红细胞系/% 粒红比 巨核细胞/个空白对照组 8.0×106 53.5±2.8 33.5±2.7 1.6±0.2 22.5±2.4低剂量组 1.0×106 48.6±3.9#* 36.3±2.7** 1.3±0.1#** 22.8±2.5中剂量组 5.0×106 45.4±2.7## 41.3±2.7##** 1.1±0.1## 24.8±1.3高剂量组 8.0×106 42.8±6.8## 47.9±7.5## 0.9±0.3## 23.6±2.7芦可替尼组 8.0×106 46.9±5.2## 38.6±6.3#** 1.3±0.3##** 23.5±2.4

3.4 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 对脾脏、腰椎、股骨、胸骨组织病理学影响

如图2～5 所示，空白对照组小鼠脾脏、腰椎、股骨、胸骨无明显病理变化；低剂量组脾脏、腰椎、股骨无明显病理变化，胸骨中骨髓造血活跃，红系造血细胞稍增多；中剂量组腰椎无明显病理变化脾脏髓外造血，红系造血细胞明显增多，胸骨骨髓造血活跃，红系、粒系造血细胞均明显增多；股骨骨髓造血活跃，红系造血细胞稍增多，高剂量组脾脏髓外造血，红系造血细胞明显增多，腰椎、股骨、胸骨骨髓造血活跃，红系、粒系造血细胞均明显增多；芦可替尼组脾脏、股骨、腰椎均无明显异常，胸骨骨髓造血活跃，红系造血细胞稍增多。

图2 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 对脾脏组织病理学影响（200×）Fig 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of the spleen（200×）

图3 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 对腰椎组织病理学影响（200×）Fig 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of lumbar spine（200×）

4 讨论

图4 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 对股骨组织病理学影响（200×）Fig 4 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of femur（200×）

图5 不同浓度BA/F3-JAK2V617F 对胸骨组织病理学影响（200×）Fig 5 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of sternum（200×）

与人类疾病相似性高的动物模型是进行药效学与药理学研究的实验基础，肿瘤动物模型建立的首要步骤是防止动物的免疫系统将移植的肿瘤细胞杀死。本研究采用1.0 Gay 射线全身照射的方式破坏小鼠的免疫系统，并在辐照24 h 内注射不同浓度的BA/F3-JAK2V617F细胞建立PV 模型，探索不同浓度的BA/F3-JAK2V617F细胞对模型建立的影响。研究结果表明，尾静脉注射中、高剂量BA/F3-JAK2V617F细胞后小鼠各项生物学指标结果与临床PV 患者表现的HGB、RBC、HCT 增多、脾脏肿大、髓外造血、骨髓粒、红与巨核细胞系增生活跃等生物学特点相似[9-11]。且芦可替尼作为JAK2 激酶抑制剂，临床常用于治疗PV 继发的骨髓纤维化以及对羟基脲无应答或不耐受的PV 患者[12]。在本研究中芦可替尼能明显抑制PV模型小鼠血液中RBC、HGB、HCT 的增加，降低脾脏重量与脾指数，抑制骨髓中的红细胞系增多，并能显著抑制脾脏造血红细胞以及腰椎、股骨、胸骨红系、粒系造血细胞的增多。以上指标表明BALB/c 小鼠经尾静脉注射1.0×106～1.6×106个·mL－1稳定转染的BA/F3-JAK2V617F细胞后可构建PV 模型，能较好地模拟PV 在体内的发展过程，为寻找新的治疗方案提供一定基础。