大分子药物透皮递送策略研究进展

王菁华，程曼曼，施沁青，尹莉芳，秦超（中国药科大学，南京 211100）

经皮给药是将药物通过皮肤以固定的速度输送到体循环中，起到局部或全身治疗作用的一种给药途径[1]，作为口服、静脉注射、肌内注射等常规给药途径的一种替代方法，具有无创、易自行给药、可实现药物的持续释放、避免药物经肝的明显首过效应及频繁痛苦的皮下注射等优点[2]。然而，皮肤作为人体的第一道保护屏障，其低渗透性严重限制了大多数药物分子的透过。主要的透过屏障位于皮肤的最外层，即角质层，它由嵌入多个脂质双层中的富含角蛋白的细胞组成[3]。为了穿透角质层，药物必须通过富含角蛋白的细胞周围曲折的脂质路径，或在富含角蛋白的水相和脂质相之间反复分配[4]。因此，只有具有最佳理化特性（分子量小于500 Da，高疏水性以及在水性和非水性溶剂中具有足够的溶解性）的药物才能通过角质层被动转运[5]。

目前上市的大分子药物如多肽和抗体主要通过注射给药，但注射给药作为一种侵入性的给药方式，给患者带来诸多不便。同时，由于这些药物的半衰期短[6]，通常需要重复给药，降低了患者的依从性。因此，生物大分子药物的透皮给药逐渐成为研究的热点和重点，并且有了一些成功案例，例如Transdermal Specialties 公司研发的U-Strip 超声波透皮给药系统，胰岛素贴片（Insulin Patch）应用特殊的超声波传输，扩张皮肤毛孔，使大分子药物穿透汗毛孔进入血液；又如Prometheon Pharma 公司推出的NoPricks 无针胰岛素贴片，使用简单方便且经济实惠，可作为胰岛素注射针剂的替代品。但是生物大分子药物的分子量高、独特的亲水性和带电状态等[7-8]造成的屏障作用仍然是相关药物研发需要克服的困难。目前，已经研发出多种物理、化学和药剂学方法来完全或部分规避角质层的屏障功能，以此来增加皮肤对大分子药物的通透性。本文综述了近年来生物大分子药物透皮递送策略的研究进展。

1 物理方法

1.1 微针

微针装置是通过将数百个微针阵列排列在一个微小的贴片上制成的，通过递送足够数量的药物以产生治疗效果。它刺穿角质层，将药物置于表皮或真皮上层，然后进入体循环，并在到达作用部位时发挥治疗效果[9]。该技术的特点是起效快、患者依从性好、能自我给药、渗透性好。微针的分类取决于其传递药物的方式，具体来说，可分为固体微针、涂覆微针、可溶性微针、中空微针[10]。固体微针给药首先于皮肤上创建微通道后去除微针，然后药物在表面分层扩散。涂覆微针是通过在固体微针表面涂覆药物实现的。可溶性微针，是利用生物可降解材料和活性成分制备的，一旦其被注射到皮肤中就会溶解并释放药物。中空微针由中空通道组成，微针插入后通过这些通道将药物注射到皮肤中。

图1 不同药物传递方式的微针示意图Fig 1 Sketch map of microneedles of different drug delivery methods

微针在1976年首次被提出[11]，其形式为透皮贴片，带有微尺度突起，能够破坏皮肤和其他上皮组织的角质层，形成微孔道，外部分子可通过其被动扩散。但针体不触及真皮层及神经末梢，穿刺疼痛感较小，形成的微孔道可在给药后自行修复[12]。微针载药能力较低，但生物大分子药物如肽类、蛋白质、DNA 和RNA 等给药剂量通常较低，因此这类药物的经皮递送可以用微针实现。

糖尿病患者通常需要一天内多次注射胰岛素来控制血糖，不仅给患者带来了极大的痛苦，而且增加了血糖浓度的波动。Chen 等[13]设计了一个具有多重释药能力的集成微针贴片。它由3 个不同的基质材料（例如明胶、交联凝胶和交联凝胶/透明质酸微粒混合物）或不同类型的胰岛素（例如短中效和长效胰岛素）组成的隔室，这3 个隔室在应用过程中可以独立控制胰岛素的释放。快速分离技术和多个单微针阵列的结合可以在数秒内有效地将胰岛素送入皮肤并且快速响应葡萄糖水平的升高，有效降低了日内的血糖浓度波动。

相比于注射给药，微针递送疫苗具有更大的优势[14]。微针靶向表皮和真皮中的抗原细胞富集区，使得在较低的抗原水平下可以引起更强的免疫反应。此外，疫苗在储存及运输方面的局限性也会随着微针技术的应用大大降低，Turvey 等[15]通过使用0.5%的羧甲基纤维素和7.5%的海藻糖制造出可以在室温下干燥保存3 周的登革热微针疫苗，疫苗经微针皮内接种后显示出强烈的中和抗体反应，可以保护人体免受病毒攻击。有研究报道[16]，将包含针对B/Yamagata（B-Y）和B / Victoria（B-V）流感疫苗的涂料溶液填充到容器的两个隔间中，将间隔微针阵列（CMA）与容器的两个隔间对准，B-Y和B-V 两种抗原在未混合的情况下成功装载到CMA 上，两种疫苗平均分布在微针针尖上，无需混合即可将多价疫苗作为单一产品注入皮肤。

siRNA 由于其能可逆地沉默靶基因而在疾病治疗方面显示出巨大的潜力，但因输送不足而受阻。通过整合滚动结构和微针电极阵列，设计了一种新型的滚动微针电极阵列（RoMEA）（见图2），可以在低压下实现大范围组织中核酸的连续有效电穿孔[17]。RoMEA 通过在靶点表面滚动将核酸连续地输送到所需组织中，暴露的微针电极长度（高度）仅为500 μm，这些细微的微针可以在皮肤下产生足够的电场，以便在低压下进行有效转染。因此，插入损伤和电灼伤都可以显著降低，甚至消除。与传统的电穿孔方法相比，这种微创设备可以同时进行大面积的滚动和电穿孔，为临床应用提供了更大的潜力。

图2 RoMEA 示意图[16]Fig 2 Schematic illustration of RoMEA[16]

目前已经有微针产品上市，例如Valeritas公司设计出一种中空微针给药系统V-Go，用于递送治疗成人2 型糖尿病的胰岛素；Becton Dickinson 公司研发出可以实现疫苗精确接种的产品BD Soluvia。现阶段的微针实现产品转化仍存在一定困难，因微针的载药量及机械强度会影响给药效果，难以批量生产。随着研究的深入，相信微针未来的应用前景广阔。

1.2 分级激光（AFL）

激光通过光热效应破坏角质层，从而促进生物大分子药物透皮吸收。激光发射激光束，烧蚀微小的皮肤组织，产生皮肤微通道，药物可以通过微处理区穿透表皮屏障后被吸收[18]。微通道通过增加吸收的总面积来增强扩散，同时光声波也可以通过扩大细胞间脂质双层膜内的腔隙空间来提高药物的扩散率[19]。这种激光辅助的经皮给药方式尺寸和深度高度可控，但对皮肤存在一定的创伤，需要后续修复。皮肤角质层消融程度与激光能量高度相关，低激光能量导致角质层消融效率低下，而高激光能量会引起明显的皮肤反应，分级激光（AFL）就解决了这一问题。AFL 发出高能微激光束，以消融微小的皮肤组织并产生皮肤微通道。AFL 产生的微通道直径通常为数十至数百微米，由于激光消融的皮肤范围较小，皮肤可以在短时间内恢复。

Er∶YAG 激光和CO2激光是两种常见的分级激光，可在皮肤表面形成一系列显微垂直烧蚀组织通道。Er∶YAG 一般用于促进各种小分子药物的透皮给药，如咪喹莫特、双氯芬酸、利多卡因和甲氨蝶呤。然而，其对水溶性蛋白质、抗体和RNA的透皮给药研究较少。Zhang 等[20]的研究表明，Er∶YAG 可帮助水溶性抗体T-IgG 实现有效可控的经皮给药，便于红斑狼疮的微创检测。激光通量和密度增加会显著提高T-IgG 渗透率。T-IgG 负载浓度的增加导致整个透皮递送过程的持续增加。Lee等[21]第一次成功地使用Er∶YAG 和CO2激光器来增强siRNA 和pDNA 的皮肤传递，且CO2激光比Er∶YAG 激光增强透皮传递的效果更好。因为CO2激光在皮肤表面的烧蚀作用总是伴随着热效应，以加速药物渗透进入皮肤。进一步研究发现，CO2激光可使裸鼠和猪皮肤的siRNA 通量分别提高33 倍和14 倍，可使siRNA 渗透增强，改善银屑病样病变，从而改善斑块，治疗银屑病样病变[22]。

1.3 低频超声导入（LFS）

使用超声波来促进药物经皮穿透的方法，被称为超声导入，在过去的几十年里引起了研究者相当大的兴趣并得到了广泛的应用。该领域的最初研究是在治疗频率1 ～3 MHz 进行的，而最近的研究重点是在20 ～100 kHz 内的低频超声导入（LFS），低频超声的促透效果优于高频超声，其超声的促透机制可能与其产生的热效应、空化效应和对流作用有关。Polat 等[23]综述了LFS 介导的经皮给药的相关机制（见表1）。此前，使用LFS进行经皮给药需要到医院进行操作，经过进一步的研究，Jabbari 团队[24]开发了一种便携的超声仪，可用于经皮超声促透，可在60 min 内利用40 kHz 脉冲通过皮肤向体内传递胰岛素，患者可以在家里自主给药。但超声波促渗技术仍存在一定的局限性，针对不同药物的超声条件不同，修改调整步骤繁琐等，尚需要完善相关配套技术[25]。

表1 低频超声电泳促进药物透皮吸收的作用机制[25]Tab 1 Mechanism of low-frequency ultrasound electrophoresis in promoting drug transdermal absorption[25]

目前LFS 传递的大分子物质不仅限于胰岛素、蛋白质，还包括寡核苷酸甚至疫苗。Chae 等[26]先用500 µm 的微型针滚轮30°往复旋转约10 次，刺穿解冻后的猪皮，随后，将猪皮放置在装有siRNA 和卵白蛋白溶液的Franz 扩散池中，使用超声波液体处理器以20 kHz 的频率作用于上述溶液，可以增强siRNA 和卵白蛋白的穿透。微针和声电泳的协同经皮给药导致siRNA 和卵白蛋白的穿透率分别比阴性对照高7 倍和15 倍。

寡核苷酸（ODNs）选择性地干扰靶细胞中基因的表达，对于治疗皮肤疾病包括皮肤癌、黑色素瘤、牛皮癣等有显著的效果。寡核苷酸必须穿过角质层到达底层组织才能发挥药效，Tezel 等[27]利用低频超声（20 kHz，2.4 W·cm－2）将大量反义寡核苷酸导入皮肤，超声10 min 后，皮肤浅层寡核苷酸的浓度大概为供体浓度的0.5%～5%。

Tezel 等[28]研究了LFS 介导的疫苗接种，将小鼠皮肤和破伤风类毒素溶液进行超声处理后经皮给药，可以增强应用破伤风类毒素引起的免疫反应。一方面是由于超声增加疫苗的递送，从而使足够量的疫苗进入皮肤，激活皮肤的免疫反应；另一方面是由于超声激活了郎格汉斯细胞和皮肤免疫细胞，它们能有效地捕捉抗原并呈递给免疫系统。

2 化学方法

2.1 离子液体（ILs）

ILs 是一类由熔点在100℃以下的离子组成的化合物，由阴离子和阳离子两个部分组成（见图3）。有机阳离子通常体积庞大，而无机阴离子则相对较小，这种结合导致了体系结晶度的降低，使ILs 在低温下呈液态[29]。ILs 可以绕过角质层的屏障，采用破坏细胞完整性、流化、在角质层中形成扩散途径和提取脂质成分等机制来增强跨细胞和细胞旁的药物转运。与乙醇等常规化学渗透促进剂相比，ILs 对细胞的毒性更小，减轻了许多化学增强剂的皮肤刺激问题。

图3 构成离子液体的阳离子和阴离子[30]Fig 3 Anions and cations in the ionic liquid [30]

在不同的ILs 中，胆碱-香叶酸（CAGE）表现出较强的抗菌活性，无需使用任何物理/化学渗透增强技术，可改善蛋白质抗菌药物[如牛血清白蛋白（66 kDa）、卵白蛋白（45 kDa）和胰岛素（5.8 kDa）]的透皮给药，而不会对角质细胞和小鼠造成明显的毒性[30]。研究表明，CAGE 是一种有前途的治疗性蛋白透皮递送载体，作为一种非侵入性的方式治疗糖尿病。Tanner 等[31]研究了CAGE 离子液体中阳离子/阴离子比率对胰岛素透皮递送的影响，发现含有过量香叶酸（1∶2 和1∶4）的ILs 表现出更高的胰岛素透皮递送效果。

脂肪酸是油基皮肤渗透促进剂中疏水性阴离子的强力候选者，Tahara 等[32]将一种在癌细胞中过表达的亲水性抗原肽通过胆碱-脂肪酸离子液体介导的皮肤渗透系统传递，发现在各种不同链长和不同饱和程度的脂肪酸中，油酸（C18∶1）在细胞毒性、抗原肽的皮肤渗透和对油基皮肤渗透增强剂的亲和力方面表现出最优性。抗原肽在胆碱-油酸离子液体的作用下经皮给药，显示出明显的抗肿瘤作用。这些结果表明，有生物相容性的胆碱-油酸离子液体具有改善透皮肽递送的潜力。

2.2 透皮肽

透皮肽通常是由10 ～30 个氨基酸（1000 ～1500 Da）构成的小肽，被认为是化学渗透促进剂的安全替代品[33]，具有无创、无毒且无刺激性的特点，透皮肽利用其所具有的大分子物质转导功能，将一些自身无法透皮的药物携带透过皮肤。透皮肽可携带转运的药物分布广泛，从普通药物到siRNA、质粒、DNA、蛋白质等都能被透皮输送，显示了强大的透皮介导能力。透皮肽按其来源可分为细胞穿透肽（CPPs）和透皮增强肽（TEPs）两类。

CPPs 是一系列具有高度亲水性的阳离子或两亲性短肽，由带正电荷的氨基酸组成，主要来源于现有的天然蛋白质。CPPs 能够在体内外低摩尔浓度的情况下穿透细胞膜，而不需要任何受体，也不会造成明显的膜损伤[34]。在已发表的文献中，用来促进大分子药物透皮吸收最多的CPPs是多聚精氨酸。研究表明，经预处理的聚精氨酸可进入或作用于表皮细胞和真皮细胞。因此，有可能通过透皮将蛋白和亲水药物递送到各种细胞中[35]。Hou 等[36]证明了非共价关联的富含精氨酸的细胞内递送（AID）肽能够促进蛋白质向动物细胞内的递送并迅速渗透皮肤组织，这种透皮递送是由非毒性AID 肽以非融合蛋白和非结合依赖性方式介导的。在化学增强剂油酸的存在下，细胞内运输的效率进一步提高。最近，科学家发现了一种新的CPPs，即IMT-P8，它是一种富含精氨酸的人类蛋白衍生物，能够在极低浓度下通过与绿色荧光蛋白（GFP）和促凋亡肽（KLA）重组成IMT-P8-GFP 和IMT-P8-KLA，从而将其内化到皮肤毛囊和真皮组织中[37]。

TEPs 来源于噬菌体展示肽库，大多为环肽。通过与皮肤蛋白（主要是角蛋白）相互作用，引起皮肤蛋白二级结构的变化，增加药物进入角质细胞[35]。目前已经被发现且应用广泛的肽为SPACE肽。当SPACE 肽与siRNA 等药物偶联时，可增强药物穿过角质层屏障进入表皮或真皮。SPACE 肽递送的药物通过大胞饮途径进入细胞，此途径不与内溶酶体共域，因此，该肽不会被溶酶体快速降解[38]。Chen 等[39]进一步研究，将SPACE 肽与siRNA 偶联后制备成醇质体制剂来增强siRNA 的透皮递送，该系统使siRNA 对猪皮肤的渗透性提高了（6.3±1.7）倍，表皮中siRNA 的积累增加了约10倍，siRNA 在细胞水平上的渗透性也得到增强。

3 纳米载体

3.1 囊泡

可变形囊泡（UDV），又称柔性纳米脂质体，因具有高度变形性和水化梯度驱动力，更易通过皮肤上的微孔道，将负载药物递送到表皮和真皮层中，克服了传统脂质体的不稳定性及皮肤渗透性差等特点[40]。有研究显示，与130 nm 弹性脂质体相比，将抗原包覆在40 nm 的弹性脂质体中，角质层和卵泡深层的积累更多，抗原提呈细胞更容易捕获直径为40 nm 的颗粒[41]。

作为第一代UDV，传递体主要由磷脂和边缘活化剂组成，能够通过比自身尺寸小5 ～10 倍的皮肤毛孔，可以递送肽、蛋白质等大分子药物[42]。研究发现，含有适量胆酸钠或吐温 80 作为边缘活化剂的传递体可以通过真皮传递siRNA[43]。

另一种常见的UDV 为醇质体，是由磷脂、胆固醇和乙醇组成的一种纳米载体，其中高浓度的乙醇作为化学渗透促进剂，可以改变角质层细胞脂质层的致密排列，降低结构密度，提高药物透皮吸收的效果[44]。醇质体还具备粒径小、包封率高、可变形性好、皮肤刺激性小、渗透性好、皮肤滞留量大、稳定性好等优势。醇质体的囊膜可通过变形穿过小于其自身的孔径，这一特性使其在经皮给药方面具有更多的优势，使其经皮渗透率、药物经皮渗透累积量、药物在皮肤中滞留量较其他剂型显著提高[25]。Xing 等[45]发现以醇质体为载体的表皮生长因子（mEGF）经皮渗透主要通过毛囊-皮脂腺单元，部分通过胞间结构域，最终可到达皮脂腺的各个部位。另外还发现mEGF-醇质体成功地使毛囊从休眠期向生长期转变。Zhang 等[46]以醇质体装载乙肝表面抗原，诱导全身和黏膜的免疫反应，达到预防乙肝的作用。

有研究比较了醇质体与传递体渗透瘢痕效果，证明醇质体中的乙醇改变瘢痕组织表皮角质细胞排列结构以及其囊泡表面与5-氟尿嘧啶的键合作用使其渗透性能高于传递体，但传递体的包封率高于醇质体，故其在瘢痕组织的滞留效果更好[47]。因此应根据药物的性质及皮肤的特点，选择适宜的载体。

3.2 聚合物纳米粒

聚合物纳米粒是纳米尺度上由聚合物、脂质或金属制成的粒子，可以携带载于颗粒表面或颗粒核心的药物进入皮肤。局部应用纳米颗粒可通过以下3 种不同方式穿透皮肤：① 附肢途径；② 细胞内途径；③ 细胞间途径。附肢途径包括纳米颗粒进入毛囊、汗腺或皮肤皱纹，穿透真皮或滞留以增加药物释放（见图4）；细胞内途径包括直接通过细胞膜的多层表皮；细胞间途径在表皮细胞间更为曲折。所采取的途径可能取决于纳米颗粒的大小、电荷、形态和材料[48]。与其他制剂相比，纳米载体以高分子物质为骨架，具有粒径小，表面反应活性高，表面积大和黏附力强等优点，在药物研发中开展了一片全新领域。尽管在局部应用中已被证明是有希望的，但需要更多地强调定量研究[25]。

图4 纳米粒子穿透皮肤的方式[54]Fig 4 Approach for nanoparticles penetrating the skin[54]

Mahe 等[49]将牛痘病毒吸附到聚合物纳米粒上，可深入到毛囊中，并被毛囊周围抗原提呈细胞内化，显示了纳米粒在实现疫苗无创给药的潜力。de Titta 等[50]将CpG 寡核苷酸与聚合物纳米粒偶联后经皮给药，可使树突状细胞活化增加，细胞因子分泌增强，在CpG 剂量为4 μg 时能增强疫苗的效力，从而诱导强效和持久的细胞免疫。

与传统载体相比，壳聚糖偶联的多元基纳米载体[51]具有体积小、柔韧性好、亲水性蛋白储集性能好等特点，在保持其生物活性的同时，使不同大小的亲水性蛋白（包括牛血清蛋白和胰岛素）具有显著的透皮性。Tu 等[52]用离子凝胶法制备的n-三甲基壳聚糖纳米粒驻极体（TMC NPs）可增强蛋白质药物的透皮给药。TMC NPs 结合驻极体是一种无毒、稳定、灵活、方便的系统，为蛋白质药物的透皮给药提供了一个新的平台。另外发现壳聚糖层包覆金纳米粒子也可作为 siRNA 的载体，皮肤穿透深度在50 ～100 μm，可以到达黑素细胞的靶点，用于离子热释治疗黑素瘤[53]。

3.3 微乳

微乳状液是热力学稳定、透明的胶体药物载体系统，它是亲油亲水物质经适当的表面活性剂和助表面活性剂稳定后的自发各向同性混合物，具有较强的组织亲和力，可使活性成分经皮扩散速率增加。同时，微乳在皮肤中有蓄积药物的作用，能维持较高的药物浓度，提高微乳与皮肤间的药物浓度梯度，从而增加透皮速率，其易于制备、增溶作用、药物分散性好、对亲水和亲脂两种药物都具有亲和性，使其在皮肤药物递送方面优于其他载体系统[54]。微乳降低了皮肤表面的界面张力，使药物溶解，其中的渗透增强剂有时可溶解或干扰角质层的脂质双层结构。通过这种方式，最大限度地降低了角质层的屏障功能，为药物在皮肤上的渗透打开了一个孔或通道。同时渗透增强剂改变了角质层的脂质双分子层和角化细胞的排列，使药物以特定的速度渗透[55]。但是微乳作为经皮给药的载体在制剂上还存在一些问题，如缺乏黏附性，在皮肤上难以涂布和滞留；长期存贮时水分容易蒸发等。这些问题都制约着微乳制剂产品的发展，有待进一步研究探索[25]。

油包水微乳液已被证明具有将水溶性肽和蛋白质输送到皮肤的能力。研究发现，放射标记的抗肿瘤坏死因子单克隆抗体可迅速进入刮除小鼠皮肤的真皮层，然后通过皮肤横向移动到远端区域和肌肉[56]。Szumała 等[57]通过优化聚合物浓度和微乳液的增溶能力，使微乳液能够促进胶原蛋白和透明质酸的皮肤渗透性，用于衰老、病变皮肤的改善和再生。

Cui 等[58]报道了一种新型的掺有质粒DNA 的乙醇/全氟苯磺酸微乳剂，将其应用于剃毛的小鼠皮肤后，可显著增强针对该质粒DNA 编码的模型抗原的特异性免疫反应。室温条件下为期3 个月的稳定性研究证明该微乳液是稳定的，使用含有炭疽保护抗原蛋白编码质粒的微乳液在小鼠皮肤上局部免疫，可导致显著的抗原特异性抗体反应，具有炭疽致死毒素中和活性[59]。

T4 噬菌体是一种天然的、安全的、不干扰人体菌群的抗菌剂[60]。由于口服给药途径是在酸性极强的环境下影响噬菌体的生存能力和稳定性，Rastogi 等[61]以微乳化为基础的噬菌体透皮给药治疗耐药菌感染，发现微乳不仅可以保护噬菌体，而且能增加皮肤屏障的通透性。该方法的有效性和安全性仍需要进一步临床试验，但以微乳化为基础的噬菌体经皮给药无疑是治疗耐抗菌药物细菌引起的感染的一种有前景的方法。

4 小结

综上所述，近年来生物大分子透皮给药的理论及技术均取得了一定的进展。随着新材料、新工艺和新设备的不断发展，透皮给药技术已从第一代简单地依赖于化学物质自然扩散的方法发展到第四代利用可穿戴设备外部刺激的药物释放系统，包括化学促渗剂、微针技术、离子导入技术、超声促渗技术、激光促渗技术和纳米载体等。经皮给药系统理论和促渗透方法的研究，使更多药物开发成经皮给药制剂成为可能。但生物大分子药物透皮给药系统的开发仍处于早期阶段，从实验研究过渡到临床应用，中间还存在一些需要解决的实际问题，比如给药装置的实用性，方法的安全性等问题。总之，与口服给药和注射给药相比，生物大分子的经皮给药方式不失为一种潜力巨大的给药方式，如何进一步提高药物通过皮肤的效率，探索它们在各种疾病模型中的应用，使现在难以透皮吸收的大分子药物可以实现透皮给药，是亟待解决的问题和未来研究的方向。