对氨甲苯酸注射液中特定杂质4-甲酰基苯甲酸的研究

张耀文，于明，李沫，孙苓苓*（1.辽宁省检验检测认证中心，沈阳 110036；2.辽宁省药品检验检测院，沈阳 110036）

氨甲苯酸（aminomethylbenzoic acid monohydrate），又称止血芳酸，化学名为对氨甲基苯甲酸一水合物，分子式为C8H9NO2·H2O。氨甲苯酸是一种抗纤溶止血药，国内于1968年开始生产。氨甲苯酸临床上主要用于原发性纤维蛋白过度溶解所引起的出血，包括急性和慢性、局限性或全身性的高纤溶出血的治疗[1-2]。本次国家计划抽验的品种氨甲苯酸注射液共抽样153 批，执行《中国药典》1995年版二部标准和国家食品药品监督管理局标准，《中国药典》2020年版和国外药典均未收载。

药品中的有关物质是否能得到合理、有效的控制，直接关系到其质量的可控性与安全性。本次总计153 批次的氨甲苯酸注射液按现行质量标准检验，结果均符合规定，其中4 个生产企业的样品（约占36%）执行标准中无有关物质检查项，不能评价制剂中工艺杂质和降解产物的情况。目前国内仅有少量文献对氨甲苯酸注射液的有关物质测定方法进行研究[3-6]，未有文献针对氨甲苯酸中的杂质进行过定性鉴别及定量测定。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术（UHPLC-Q Exactive Focus MS）结合了超高效液相色谱的高分离能力和高分辨质谱的高灵敏度、高选择性、高分辨率等检测优势，可获得丰富有效的化合物多级质谱、精确相对分子质量等信息，保证了结果的可靠性和准确性[7-10]。本试验采用2020年3月颁布的氨甲苯酸注射液质量标准WS1-（YH-002）-1995-2020 中的色谱条件，对153 批样品进行有关物质检查，利用半制备柱从样品中制备杂质，并建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法对杂质进行结构鉴定及定量分析，进一步完善质量标准，以期对本品的安全性进行全面评价。

1 仪器与试药

Waters e2695 液相色谱仪、Waters 2487 液相色谱仪、Waters 2998 UVD 检测器（美国Waters 公司）；BUCHI R-210 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；Vanquish 超高效液相色谱仪、四极杆-轨道阱质谱仪、结构解析软件Mass Frontier（美国Thermo公 司）；XP205型电子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 计（瑞士Mettler-Toledo 公司）；小分子未知物定性软件Compound Discoverer（美国Thermo 公司）。

氨甲苯酸注射液为国家评价性抽验样品，共153 批，涉及9 个生产企业；4-甲酰基苯甲酸（批号：MKLB 3894V，SIGMA-ALDRICH，纯度：98.5%）；氨甲苯酸对照品（批号：100921-201702，中国食品药品检定研究院，纯度：97.8%）；氨甲苯酸原料药（湖南洞庭药业，纯度：99.9%，批号：W1903010），乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 有关物质的检测与制备

2.1.1 有关物质色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠11.0 g，辛烷磺酸钠1.0 g，加水800 mL 使溶解，用磷酸调节pH 值至2.52，加水至900 mL）-乙腈（88∶12）；柱温：40 ℃；流速：1 mL·min－1；进样体积：10 μL；检测波长：230 nm。

2.1.2 有关物质溶液的配制 精密量取氨甲苯酸注射液样品1 mL 置25 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取氨甲苯酸原料药10 mg 置25 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 有关物质检测结果及分析 取“2.1.2”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，氨甲苯酸注射液及原料药典型图谱见图1。

图1 氨甲苯酸注射液（A、B）和原料药（C）色谱图Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection sample（A、B）and API（C）

在A 企业氨甲苯酸注射液有关物质色谱图中，与主成分峰相对保留时间约为1.83 的杂质峰1 峰面积大于对照溶液主峰面积（0.1%），超出标准规定的最大单个杂质限度。该杂质的PDA 光谱图显示，其紫外最大吸收波长为254 nm，在230 nm 检测时，该杂质被低估，见图2。通过与原料药色谱图对比，发现氨甲苯酸注射液色谱图中该杂质的含量高于原料药，为注射液中特定的杂质。

图2 氨甲苯酸峰与杂质峰1 光谱图Fig 2 Spectra of aminomethylbenzoic acid and impurity 1

2.1.4 半制备色谱条件 半制备色谱柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×10.0 mm，5 μm）；流动相：20 mmol·L－1醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱温：35℃；流速：2 mL·min－1；进样体积：1 mL；检测波长：254 nm。

2.1.5 有关物质的制备 取A 企业样品，精密吸取1 mL，注入色谱仪，按“2.1.4”项下方法测定，收集目标流份，置旋转蒸发仪蒸干溶剂，用少量乙醇转移至小瓶中，重结晶，即得。

2.2 LC-MS 定性鉴别

2.2.1 LC-MS 色谱条件 色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）； 流动相：20 mmol·L－1醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）；柱温：35℃；流速：0.5 mL·min－1；进样体积：2 μL；检测波长：254 nm。

喷雾电压：3500 V，雾化温度：350℃，鞘气压力：45 arb，辅助气压力：15 arb，离子传输管温度：320℃，扫描模式：Full Scan-ddms2，扫描范围：m/z75 ～750，分辨率：70 000 ～17 500。

2.2.2 LC-MS 定性鉴别结果 利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 对杂质的一、二级质谱图进行分析，确定化合物及二级碎片裂解规律。

一级质谱图给出分子离子峰m/z149.02442，二级质谱可见两个碎片离子峰（m/z105.03459和m/z121.02950），运用Mass Frontier 软件辅助Compound Discoverer 软件，对该化合物的碎片结构进行归属，推测该杂质为4-甲酰基苯甲酸。质谱图及裂解途径见图3～4。

图3 4-甲酰基苯甲酸离子流图和质谱图Fig 3 EIC and mass spectrum of 4-formylbenzoic acid

图4 4-甲酰基苯甲酸碎片裂解途径Fig 4 Fragmentation pathway of 4-formylbenzoic acid

2.3 4-甲酰基苯甲酸的结构确定

按“2.1.5”项下方法半制备获得的目标杂质与4-甲酰基苯甲酸对照品液相色谱一致，确定该杂质为4-甲酰基苯甲酸（见图5）。

测定不同比例反应后的纳米颗粒以及反应前脂质体Zeta电位，重复测三次；动态光散射技术（DLS）测定脂质体粒径；透射电镜（TEM）观察脂质体形态，取阳离子脂质体质量：siRNA质量为5:1的样品组，直接滴加在铜网上，静置空气中干燥30 min后测试。

图5 4-甲酰基苯甲酸对照品（A）和制备杂质样品（B）色谱图Fig 5 HPLC chromatogram of 4-formyl benzoic acid standard（A）and prepared impurity（B）

3 方法学验证

3.1 专属性

精密称取氨甲苯酸对照品和4-甲酰基苯甲酸对照品适量，加流动相制成含氨甲苯酸为20 μg·mL－1及4-甲酰基苯甲酸为10 μg·mL－1的系统适用性溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，结果表明主成分氨甲苯酸与杂质4-甲酰基苯甲酸达到良好分离，空白溶液不干扰主成分和杂质的测定。

3.2 线性范围与校正因子考察

精密称取氨甲苯酸对照品适量，用流动相稀释制成质量浓度分别为1.10、4.40、5.50、11.1、44.0 和55.0 ng·mL－1的系列对照品溶液。精密称取4-甲酰基苯甲酸适量，用流动相稀释制成质量浓度分别为1.22、4.88、6.10、12.2、48.8 和61.0 ng·mL－1的系列对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各杂质的质量浓度（C，ng·mL－1）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，结果线性方程氨甲苯酸为Y＝4855X－44.21，r＝1.000；4-甲酰基苯甲酸为Y＝1687X－330.5，r＝1.000。采用主成分与杂质线性方程斜率比较法计算4-甲酰基苯甲酸的校正因子f＝2.88。

3.3 重复性试验

精密量取A 企业氨甲苯酸注射液1 mL 置25 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1.1”项下条件进样分析，4-甲酰基苯甲酸的含量RSD为0.44%，表明方法重复性良好。

3.4 准确度试验

精密称取4-甲酰基苯甲酸对照品10.14、20.19 和30.37 mg，分别置250 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成50%、100%、150% 3 个浓度水平的对照品溶液，精密量取1 mL，置25 mL 量瓶中，各3 份。再精密量取B 企业氨甲苯酸注射液1 mL 置上述25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

按“2.1.1”项下条件进样分析，计算回收率，4-甲酰基苯甲酸回收率为97.85 ～102.6%，RSD为1.4%，表明本方法准确度良好。

3.5 稳定性试验

取样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，于0、2、4、8 和10 h 分别进样测定，记录峰面积。结果样品中杂质峰面积RSD为0.50%，表明4-甲酰基苯甲酸在10 h 内稳定性良好。

3.6 4-甲酰基苯甲酸的检测限和定量限

分别以3 倍和10 倍信噪比（S/N）测定方法的检测限和定量限，得4-甲酰基苯甲酸检测限和定量限分别为0.27 ng·mL－1和1.07 ng·mL－1。

3.7 加校正因子的主成分自身对照法与外标法比较

精密吸取“3.3”项下样品溶液1 mL 置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再精取1 mL 置20 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

精密称取4-甲酰基苯甲酸20.19 mg 置250 mL量瓶中，加甲醇10 mL 使之溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，精取0.25 mL 置25 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别吸取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1。加校正因子的主成分自身对照法与外标法测定结果一致，可以采用加校正因子的主成分自身对照法计算样品中4-甲酰基苯甲酸的含量。

表1 加校正因子的主成分自身对照法与外标法测定结果Tab 1 Main component self-compare with orrection factor method and external standard method

3.8 样品有关物质测定

按有关物质检查方法，对9 个生产企业153批氨甲苯酸注射液的有关物质进行考察。结果表明5 个企业101 批样品未检出4-甲酰苯甲酸，2个企业38 批样品中4-甲酰苯甲酸含量小于0.2%，2个企业14批样品中4-甲酰苯甲酸含量大于0.2%。

4 讨论

4.1 半制备色谱条件和色谱-质谱条件的确定

为建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法对杂质进行结构鉴定，本试验在WS1-（YH-002）-1995-2020 标准中有关物质色谱条件的基础上，采用醋酸铵溶液代替了磷酸盐缓冲液，流动相为20 mmol·L－1醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH 值至4.0）-甲醇（80∶20）时，基线稳定，空白溶剂对于测定无干扰，并且在该流动相下，在半制备液相中，氨甲苯酸与4-甲酰苯甲酸能达到良好分离，便于收集目标杂质。

4.2 有关物质检查项修订

采用氨甲苯酸注射液质量标准WS1-（YH-002）-1995-2020 中有关物质检查项色谱条件对氨甲苯酸注射液中杂质情况进行深入研究，该方法优于各企业现行注册标准。在本项探索性研究中定性了氨甲苯酸注射液中杂质4-甲酰基苯甲酸，紫外最大吸收波长为254 nm，在230 nm 的检测波长下校正因子为2.88，因此需按加校正因子的主成分自身对照法计算其含量。

结合样品测定结果及ICH Q3B（R）关于日最大剂量在100 mg ～2 g 的制剂（本品为0.6 g）中杂质的质控限度[11]，拟定杂质限度为0.2%。

4.3 杂质4-甲酰基苯甲酸产生机制

通过与氨甲苯酸原料药有关物质色谱图比较，有的企业生产的注射液中4-甲酰基苯甲酸的含量远远高于原料药，氨甲苯酸注射液与氨甲苯酸原料中的4-甲酰基苯甲酸产生途径不同，该杂质在原料药中来自对甲基苯甲酸氯化副产物，注射液中的4-甲酰基苯甲酸可能与注射液生产工艺和在某种条件下（光、热和氧的作用）的降解有关。推测其产生机制如图6所示。

图6 氨甲苯酸产生机制Fig 6 Production mechanism of aminomethylbenzoic acid

5 结论

本试验对氨甲苯酸注射液中的特定杂质进行研究，半制备柱从样品中制备杂质，建立UHPLC-Q Exactive Focus MS 法对样品中的杂质进行结构鉴定，确定该杂质为4-甲酰基苯甲酸，并对方法的有效性进行了评价，计算出该杂质的相对校正因子，对现有的质量标准进行了修订，进一步完善氨甲苯酸注射液的质量标准，以对本品的安全性进行全面评价，为氨甲苯酸注射液的质量控制奠定了基础。